摘要】 目的 探讨重组人内皮抑素（恩度）对肺鳞状细胞癌细胞系h520细胞生长的影响及其机制。方法 应用四甲基偶氮唑盐（mtt）法检测恩度不同浓度和作用时间对h520细胞的生长抑制作用；hoechst33258染色观察恩度处理后细胞凋亡形态并通过流式细胞术对凋亡细胞进行定量及检测细胞周期分布。采用划痕修复实验检测内皮抑素处理后h520细胞的迁移能力。结果 恩度可以抑制h520细胞的生长，且呈时间剂量依赖性；恩度可以促进h520细胞的凋亡，随时间延长，凋亡率显著增加，与对照组相比，差异具有统计学意义（p<0.01）；恩度可以引起h520细胞周期分布变化，细胞发生g0/g1期阻滞。划痕实验表明，恩度可以使h520细胞体外迁移能力显著下降，与对照组相比，24h划痕修复率差异具有显著意义。结论 恩度对h520细胞增殖具有明显抑制作用；其主要机制为促进细胞凋亡，调整细胞周期分布和减弱细胞迁移能力。
【关键词】 内皮抑素；恩度；肺鳞状细胞癌；生长抑制；细胞凋亡
inhibitory effects of lung squamous cell carcinoma in vitro by endostar
you zhenyu1,wang junjie1,zhao yong2,zhuang hongqing3,liu feng1,zhang ying dong1
1.department of radiation oncology, the 3rd hospital, peking university, beijing 100083,china;2.transplantation biology research division; state key laboratory of biomembrane and membrane biotechnology; institute of zoology; chinese academy of sciences; 3 department of radiation oncology, tianjin medical university cancer hospital
corresponding author: wang junjie, [email protected]：objective to investigate the inhibitory effect of endostar on human lung squamous cell carcinoma cell line h520 and to reveal the possible mechanism of the inhibition. methods the effect of endostar with various concentrations on the proliferation of h520 cell was studied by mtt assay. hoechest33258 staining was used for morphological examination and flow cytometry was used to detect the apoptosis and cell cycle distribution. wound healing assay was used to evaluate the migration of h520 cell after administration of endostar. results endostar inhibited h520 cell proliferation with timedose dependent style and induced cell apoptosis,the apoptosis rate was increased with the raise of endostar concentration(p<0.01).flow cytometric analysis showed that cell cycle distribution changed and g0/g1 arrest occurred after exposure to endostar. wound healing assay indicated that cells after administration of endostar were far less motile than control groups. the wound healing ratio after 24h between the endostar exposure and controls was significantly different. conclusion endostar inhibits proliferation of h520 cells by inducing apoptosis,changing the cell cycle distribution and attenuating cell migration.
key words：endostatin; endostar; lung squamous cell carcinoma; growth inhibition; cell apoptosis
随着肿瘤靶向治疗研究的深入，肿瘤的血管形成逐渐成为研究的焦点。wWW.11665.cOm1971年，folkman教授在《新英格兰医学杂志》首次提出肿瘤体积超过2mm3时便需要其新生血管提供营养以维持继续生长[1]。自此，抑制肿瘤血管生成成为肿瘤靶向治疗的新手段。血管内皮抑素（endostatin,es）是近年来发现的一种血管生成抑制因子，其通过抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移，达到抑制肿瘤的目的。然而最近的研究表明[26]：es对部分头颈癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌等细胞系均具有直接抗肿瘤作用，即es不仅可以通过抑制肿瘤新生血管的生成而发挥作用，还可以通过直接抑制肿瘤细胞的生长而发挥作用，但其具体机制仍不清楚。本文以肺鳞状细胞癌细胞系h520为研究对象，探讨国产血管内皮抑素恩度对其体外生长的影响及其机制。
1 材料和方法
1.1 材料
h520肺鳞癌细胞系由协和医科大学基础医学所提供；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；恩度（重组人内皮抑素）由烟台麦得津生物工程股份有限公司提供；dmem购自gibco公司；碘化丙啶（pi）、四甲基偶氮唑盐（mtt）购自赛百盛公司；hoechest33258购自碧云天生物公司。
1.2 细胞培养
h520细胞选用dmem培养基培养，其中加入10%胎牛血清，青霉素与链霉素各100u/ml。置于37℃、5%co2饱和湿度孵箱中培养，2～3天传代一次。
1.3 细胞增殖情况分析
实验设恩度处理组和空白对照组，采用mtt法分析h520细胞增殖活性。将h520细胞接种于96孔板，接种细胞数为3×103/孔。待细胞贴壁后吸净上清液，恩度组分别更换含不同浓度（1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml）恩度的细胞培养液200μl，对照组加入不含恩度的完全培养液，空白孔加入200μl完全培养基，继续培养24～72h。培养结束前每孔加入20μl浓度为5mg／ml的mtt，继续培养4h，弃去培养基后每孔加入200μl dmso，振荡10min使蓝紫色结晶充分溶解,用酶标仪于592nm下读取每孔的吸光度值（od值）。根据od值分别计算不同浓度恩度处理后细胞的生长抑制率，生长抑制率=（对照孔od值-实验孔od值）/对照孔od值×100%，绘制细胞生长抑制率曲线。
1.4 凋亡细胞的检测
h520细胞经恩度（200μg/ml）处理72h后，用carnoy固定液固定10min,再用浓度为1μg／ml的hoechst33258染液37℃孵育染色30min,荧光显微镜下观察拍照。
1.5 细胞周期和凋亡检测
h520细胞用恩度（200μg/ml）处理24、48、72h后，收集细胞，用70%乙醇4℃固定24h,加入rna酶至终浓度为100μg/ml,加入pi至终浓度50μg/ml，37℃避光染色30min，流式细胞仪检测。
1.6 划痕修复实验
先将1×105个细胞接种于24孔板，培养过夜使细胞完全贴壁并铺满孔底。用200μl枪头在孔底中央划一条直线，pbs冲洗2遍以去除细胞碎片。对照孔加入完全培养液，实验孔加入含有恩度的培养液，使恩度终浓度为20μg/ml，培养0～24h，倒置显微镜下观察并拍照。
1.7 统计学方法
实验数据以±s表示，利用spss13.0统计软件进行student’s t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 恩度对h520细胞增殖抑制作用
不同浓度梯度的恩度作用于h520肺鳞癌细胞24～72h后,其生长抑制情况见图1。可见，恩度对h520细胞体外生长具有明显的抑制作用,在低剂量组其抑制率增加较慢，当恩度浓度≥25μg/ml时，随浓度的增加，抑制率明显升高，呈现明显的时间—剂量依赖关系，与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.2 恩度诱导h520细胞凋亡
hoechst33258染色结果显示，h520细胞经200μg/ml的恩度处理72h后,与对照组相比细胞形态缩小，细胞核固缩或碎裂形成凋亡小体，见图2。h520细胞经200μg/ml恩度分别处理24、48、72h后，与对照组一起上流式仪检测凋亡情况。结果对照组、24、48、72h组凋亡率均值分别为0.85%、1.56%、8.67%、22.38%，与对照组比较，恩度处理后各组细胞凋亡率均显著增加，呈时间依赖性，见图3，差异有统计学意义（p<0.01）。
2.3 恩度对h520细胞周期的影响
恩度作用于h520细胞24、48、72h后，流式细胞仪检测其细胞周期变化，结果见表1。恩度能显著影响h520细胞的细胞周期，与对照组相比，恩 度处理组s期及g2/m期细胞明显减少，尤其g2/m期细胞在药物处理24h后显著减少（p<0.01），表明g2/m期细胞对恩度非常敏感。此外，g0/g1期细胞随时间延长而明显增加，细胞周期出现g0/g1期阻滞，见图3。表2 恩度（200μg/ml）作用不同时间后对h520 细胞周期分布及凋亡率的影响：表示与对照组比较p<0.05,**：与对照组比较p<0.012.4 恩度对h520细胞迁移能力的影响
用含20μg/ml浓度恩度培养液处理培养h520细胞，分别在倒置显微镜下观察处理0、24h后细胞迁移情况并拍照，见图4。对照组中，细胞迁移快，培养24h后，划痕被迁移、增殖的h520细胞修复，而恩度处理组细胞迁移慢，与对照组比较，差异有统计学意义。
3 讨论
肺癌是危害公众健康的主要疾病之一，在肿瘤相关死因中位居前列，其中80%为非小细胞肺癌[7]。大多数肺癌患者就诊时已为中晚期，以顺铂为基础的一线化疗疗效仍不尽如人意，患者治疗后中位生存期仅为2月[8]。随着人们对肿瘤生物学的认识加深，肿瘤靶向治疗成为近年来研究的热点。内皮抑素是一种新的靶向治疗药物，可以通过抑制血管内皮增殖、诱导内皮细胞凋亡、阻断血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶的信号通路、下调与血管生成相关的基因表达等多条途径发挥抗肿瘤作用。此外，有文献报道内皮抑素抑制细胞生长和迁移作用是内皮细胞非特异的，内皮抑素还可以通过直接抑制肿瘤细胞的生长而发挥抗肿瘤作用[3,6,910]。ri等[6]用endostatin（es）作用于体外培养的鼠肺癌细胞系llc，结果es可以显著抑制llc细胞的增殖并诱导其发生凋亡，而且llc细胞的粘附和迁移能力显著减弱。进一步研究发现，es可能通过与llc细胞表面的整合素α5结合发挥作用。fatima等[3]在体外实验中也发现es对结肠癌细胞系c51和ht29有抑制作用，同时可以引起细胞周期阻滞在g0/g1期。金德均等[2]研究了es对喉鳞状细胞癌细胞系hep2体外的生长影响作用，结果es对hep2细胞具有显著的抑制作用，但是目前仍无es对人肺癌细胞有体外抑制效果的报道。
本研究应用不同浓度梯度的恩度作用于h520细胞24～72h后，采用mtt法检测各浓度实验组的细胞生长抑制率，结果表明：h520细胞的生长明显受抑制，抑制率随恩度浓度和作用时间的增加而增加，呈现时间剂量依赖性。
可见，恩度对细胞的生长抑制作用是非内皮细胞特异性的，关于其作用机制，目前的主要观点是：es可以通过诱导肿瘤细胞的凋亡和细胞周期重分布、减弱肿瘤细胞的迁移和粘附能力而发挥直接抗肿瘤作用[36,11]。
本实验对恩度作用后h520细胞的凋亡情况从定性和定量方面进行了观察。实验表明：恩度可以诱导h520细胞的凋亡，而凋亡率随给药浓度的递增而增强。这种趋势与ri等[6]的报道具有相似性，国内刘梅梅等[9]亦报道内皮抑素对人卵巢癌细胞系skov3细胞生长具有抑制作用，其作用机制也是促进skov3细胞的凋亡。
细胞受损伤后， 细胞周期检测点（checkpoint）机制启动，细胞周期进程暂停，发生细胞周期阻滞，以利于dna修复或启动细胞凋亡。细胞周期检测点主要发生在两个时相之间的交界点：g1/s和g2/m。本实验中恩度作用于h520细胞可以引起细胞周期阻滞在g0/g1期，而s期和g2/m期细胞均显著减少，显然是阻止细胞由g1进入s期，以便修复受损伤的dna。但dna损伤严重无法修复时，细胞便启动凋亡程序，主动诱导细胞凋亡。这就可以解释随恩度给药浓度增加而g0/g1期细胞明显增加的原因了。关于es引起细胞g1期阻滞的分子机制，多数报道认为：es可以下调cyclind1启动子的表达，导致cyclind1活性下降。而cyclind1在由g1期进入s期过程中发挥着重要的作用，cyclind1活性下降则细胞不能进入g1/s时相转换[6,11]。
浸润和转移是恶性肿瘤的特征性表现，也是复发和治疗失败的最常见原因。肿瘤细胞迁移能力的增强是肿瘤浸润、转移关键。通过划痕修复实验我们检测了恩度处理后h520细胞的迁移能力变化，结果实验组细胞迁移能力显著减弱，表明恩度能够减弱h520细胞的浸润和转移能力。kim等[5]报道es能与卵巢癌细胞膜表面1型mmp和mmp2结合，抑制其蛋白活性，导致卵巢癌细胞迁移能力受抑制。yumi等[4]报道es可以与卵巢癌细胞膜上的整合素α5β1结合，抑制卵巢癌细胞的粘附能力，但不影响其迁移能力。
血管内皮抑制素以其毒性低，疗效确切的特点在肿瘤治疗中备受瞩目，恩度对h520细胞抑制作用及其机制研究为恩度和其他肿瘤治疗方式的结合，提高肿瘤综合治疗疗效提供了实验依据，恩度和放疗等其他传统治疗方式的联合作用将是我们下一步研究的内容。
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