【摘要】 目的 探讨p16基因第3外显子3′端非编码区c540g和c580t两个单核苷酸多态与河北省高发区食管鳞状细胞癌（escc）和贲门腺癌（gca）遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（pcrrflp）方法分析265例escc患者、238例gca患者和246名健康对照的p16基因c540g和c580t多态位点的基因型。结果 p16基因c540g三种基因型（c/c、c/g、g/g）的频率分布在escc、gca患者和对照组相比均无显著差异；p16基因c580t三种基因型（c/c、c/t、t/t）的频率在对照组和escc、gca患者组间也无显著差异（p均＞0.05）。单体型分析显示，对照组540c/580c、540c/580t、540g/580c和540g/580t单体型的频率分别为80.1%、10.4%、8.5%和1.0%，escc组单体型频率（80.8%、9.6%、8.7%和0.9%）和gca组的单体型频率（80.2%、9.2%、9.5%和1.1%）与之相比均无显著差异（p均＞0.05）。结论 p16基因c540g和c580t多态可能与河北省高发区escc和gca的易感性无关。
【关键词】 p16 基因多态性 食管鳞状细胞癌 遗传易感性
食管癌和贲门癌是消化道常见肿瘤，迄今其发病机制尚不十分清楚。Www.11665.cOmp16基因是细胞周期抑制基因和抑癌基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞的增殖及分裂，在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用。
本文应用病例－对照研究探讨了p16基因c540g和c580t多态性与河北省高发区食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，escc）和贲门腺癌（gastric cardiac adenocarcinoma，gca）发病风险的关系。
1 资料与方法
1.1 资料 收集2001～2005年间在河北省磁县、涉县经内镜普查并在当地医院经组织学证实确诊的门诊或住院的食管鳞状细胞癌患者（escc）265例和贲门腺癌（gca）患者238例，采血前均未行化疗及放疗；对照组来自2001～2005年同一地区24名体检正常的无关个体。肿瘤患者及健康对照的性别、年龄、吸烟习惯及家族史的情况均在采血后由专人询问获得。吸烟个体定义为过去或目前吸烟≥5支/日，持续至少两年以上者。将有一名一级亲属或两名以上二级亲属患有食管癌/贲门癌/胃癌的个体定义为具有上消化道肿瘤（upper gastrointestinal cancers，ugic）家族史。仅有部分病例及对照组个体获得了吸烟情况和家族史资料。
1.2 dna 提取 抽取患者及对照静脉血5ml，以枸橼酸钠抗凝，采用miller等[1]的蛋白酶k－氯化钠盐析法提取白细胞dna。
1、2、6、7：cc基因型；3、4：cg基因型；5：gg基因型；8：pcr产物；m：100bp dna 标记
图1 p16 c540g位点（msp ⅰ酶切）琼脂糖凝胶电泳图
1.3 p16 c540g和c580t基因分型 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（pcrrflp）方法进行p16 c540g和c580t基因型检测。扩增p16 c540g和c580t位点的上游引物序列为5'gatgtgccacacatctttgacct3'，下游引物序列为 5'ctacgaaagcggggtgggttgt3'，扩增片段为181bp。pcr反应体系为25μl，其中模板dna100ng，10 ×pcr buffer 2.5μl，mgcl2 2.0mm，taqdna聚合酶2.5u，dntps 250μm 和上、下游引物各250 nm。阴性对照用蒸馏水代替模板dna。pcr反应条件为：94℃10min预变性后，采用热启动加taqdna聚合酶，然后94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃继续延伸7min。分别用10u msp i（c540g）和10u hae ⅲ(c580t)对pcr产物进行酶切，37℃水浴消化过夜。酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳分离。p16 c540g c/c基因型为104bp和77bp，g/g基因型为181bp， c/g基因型为181bp、104bp和77bp，见图1。p16 c580t c/c基因型为142bp和39bp，t/t基因型为181bp，c/t基因型为181bp、142bp和39bp，见图2。
1、2：ct基因型；3、5：cc基因型；4：tt基因型；6：pcr产物；m：100bp dna 标记
图2 p16 c580t位点（haeⅲ酶切）琼脂糖凝胶电泳图
1.4 统计分析 病例及对照组的年龄比较采用t检验，snp基因型及等位基因型分布比较采用χ2检验。应用非条件logistic回归模型统计经性别、年龄、吸烟状况和ugic家族史调整后的or值和95%可信区间。统计分析应用spss11.5软件包。采用eh软件计算病例及对照组p16 c540g和c580t的单体型频率，并采用2ld软件计算两位点间的连锁不平衡。
2 结果
2.1 研究对象基本情况 escc、gca患者组的性别分布、年龄、吸烟状态、家族史与对照组相比差异均无统计学意义（p均>0.05），见表1。p16基因c540g多态和c580t多态在对照组的基因型分布均符合hardyweinberg平衡(χ2值分别为1.80和0.18，p均>0.05)，表明病例及对照的选择对结果没有影响。
2.2 基因型频率及等位基因分布比较
2.2.1 p16基因c540g多态 escc患者组和gca患者组p16基因c540g三种基因型（c/c、c/g、g/g）频率与对照组相比差异均无统计学意义（χ2值分别为0.04和0.29，p值分别为0.98和0.87，表内未显示）；其等位基因分布与对照组相比差异也均无统计学意义。以c/c基因型作参照，c/g基因型及g/g基因型分别与其相比，均不能增加escc发病风险，亦不能增加gca发病风险，见表2。
2.2.2 p16基因c580t多态 与对照组相比，p16表1 escc、gca患者及健康对照的人口学特性及p16 c540g、c580t等位基因分布
a：t检验p值 表2 p16 c540g和p16 c580t基因多态性与escc、gca发病风险
组别基因型(%)or(95%ci)or(95%ci)p16 c540gc/cc/gg/g对照组204(82.9)37(15.1)5(2.0)1.0(ref.)1.0(ref.)escc组220(83.0)39(14.7)6(2.3)0.97(0.52～1.46)a1.09(0.32～3.41)bgca组193(81.1)40(16.8)5(2.1)1.23(0.79～1.83)a0.69(0.33～3.72)bp16 c580tc/cc/tt/t对照组194(78.9)48(19.5)4(1.6)1.0(ref.)1.0(ref.)escc组211(79.6)52(19.6)2(0.8)0.97(0.63～1.54)c0.45(0.08～2.51)dgca组195(81.9)37(15.6)6(2.5)0.79(0.49～1.27)c1.46(0.40～5.30)d
a、b：相对于c/c基因型，经性别、年龄、吸烟状况和ugic家族史校正的c/g基因型(a)与g/g基因型(b)的or值；c、d：相对于c/c基因型，经性别、年龄、吸烟状况和ugic家族史校正的c/t基因型(c)与t/t基因型(d)的or值表3 p16 c540g和c580t基因多态性单体型频率与escc、gca发病风险
单体型对照组escc组gca组例数(%)例数(%)or(95%ci)a例数(%)or(95%ci)a540c/580c394(80.1)428(80.8)1.0(ref.)382(80.3)1.0(ref)540c/580t51(10.4)51(9.6)0.92(0.61～1.39)44(9.2)0.89(0.58～1.36)540g/580c42(8.5)46(8.7)1.01(0.65～1.57)45(9.5)1.11(0.71～1.72)540g/580t5(1.0)5(0.9)0.92(0.26～3.20)5(1.1)1.03(0.30～3.59)
a：与540c/580c 单体型相比，其他单体型的or值基因c580t三种基因型（c/c、c/t、t/t）频率在escc患者组中和在gca患者组中差异均无统计学意义（χ2值分别为0.85和1.70，p值分别为0.66和0.43，表内未显示）； escc患者组和gca患者组等位基因分布分别与对照组相比差异亦无统计学意义。以c/c基因型作参照，c/t基因型及t/t基因型分别与其相比，均未增加escc及gca的发病风险，见表2。
2.3 单体型分析
采用eh软件对p16 c540g和c580t两位点snp进行单体型分析显示，对照组p16的540c/580c单体型最常见（80.1%），其次为540c/580t（10.4%）、540g/580t（8.5%）及540g/580t（1.0%），escc、gca组的单体型频率与对照组相比差异无统计学意义（χ2分别为0.18和0.54，p值分别为0.98和0.91，表内未显示），见表3。采用2ld软件进行c540g和c580t两位点的连锁不平衡分析，未发现存在连锁不平衡现象(d′=0.29，p=0.45)。
3 讨论
p16基因定位于人类染色体9p21，由2个内含子及3个外显子组成。其编码的p16蛋白位于细胞核内，属于细胞周期蛋白依赖性激酶4（cdk4）的负向调节因子。在细胞分裂过程中，cdk4与细胞周期素d（cyclin d）结合，其复合体参与g1s转换的调控。p16蛋白作为cdk4的抑制剂，能与cyclin d竞争性结合cdk4，而使后者失活，最终阻止细胞进入s期。p16基因因缺失、突变等导致功能缺失，则不能抑制cdk4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。
p16基因的失活存在于大多数肿瘤中，战雪梅等[2]研究结果显示，食管癌组织中p16蛋白的阳性表达率为63.3%，与正常食管组织（90.9%）相比阳性表达率降低，且染色强度明显减弱，表明在食管癌组织中明显存在p16蛋白表达缺失，从蛋白质水平证明了p16基因失活与食管癌的发生有关。并且还发现与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关，提示p16的失活对食管癌的演进及最终使瘤细胞获得转移的潜能产生重要的作用。
p16基因失活有多重机制，如点突变、纯合子缺失、高甲基化等已在多种肿瘤包括食管癌中有过报道[3]。现已在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义、错义及移码突变。例如，hu等[4]在对56例escc的研究中发现，5例（8.9%）发生缺失，3例（5.4%）发生插入，7例（12.5%）发生点突变，表明p16基因以缺失、突变方式广泛参与各种组织的肿瘤形成。tsai等[5]在对48例口腔鳞状细胞癌的研究中发现，在11例发生p16基因缺失或突变的标本中，未检测到p16蛋白表达，表明p16基因突变与其蛋白表达有关。检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。
在p16基因第三外显子的3′非编码区存在两个相连的多态性位点c540g和c580t[68]。sauroja等[9]研究表明，c540g多态与位于cdkn2b基因第1内含子的c74a多态存在连锁不平衡，并且和p53基因低表达有关。p53与p16同属抑癌基因，参与细胞增殖和分化的调控，与细胞周期、细胞增殖密切相关，其阳性表达与食管癌的分化程度呈负相关。由于c540g和c580t均和肿瘤侵袭有关，表明这两个多态性位点可能存在功能上的关联，但其机制至今尚未清楚。
本实验对p16基因c540g和c580t两个多态性位点与escc、gca易感性的关系进行了研究。结果显示，c540g多态c/c、c/g、g/g 基因型在河北省食管癌高发区正常人中分布频率分别为82.9%、15.1%和2.0%，c580t三种基因型（c/c、c/t、t/t）频率分别为78.9%、19.5%和1.6%，这与zheng等[6]在头颈部肿瘤中的研究结果相似，表明c540g c/c纯合型与c580t c/c纯合型在正常人群中是常见基因型。c540g /c580t基因型及等位基因分布在escc和gca与健康对照组中均无统计学意义，进行单体型分析亦未发现escc、gca组的单体型频率与对照组有显著差异。本研究是基于人群的病例－对照研究，样本量较大，且病例组与对照组在性别、年龄、吸烟史及ugic家族史上匹配，基因分型清楚，10%的样本重复吻合率达100%，并符合hardyweinberg平衡（p均>0.05），结果较可靠。
本研究结果提示，p16基因c540g与c580t多态位点及单体型分布与河北省高发区escc和gca的易感性无关。
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