【摘要】 ［目的］ 探讨硫酸右旋糖苷(ds)对人胃癌mkn1细胞的黏附抑制作用机制。［方法］分别在培养液中加入ds或pbs对mkn1细胞进行培养，用荧光免疫细胞染色法进行染色，用共聚焦显微镜对固定细胞和活细胞在培养盘上的贴壁过程及形态变化进行观察，用western blotting对整合素β1蛋白的表达水平进行测定。［结果］ mkn1细胞形成伪足并与其他细胞接触形成单细胞层。整合素β1在细胞膜上有强表达并形成集落。ds使mkn1细胞的伪足缩短，表现出维持圆形形状的倾向；抑制整合素β1的表达并使已经形成的整合素集落区域减少。mkn1细胞表达了整合素β1的两种形式(130kda和110kda)，实验组贴壁细胞整合素β1蛋白的表达分别减少到对照组细胞的64%(130kda)和57%(110kda)，实验组游离细胞整合素β1蛋白的表达分别减少到对照组细胞的51%(130kda)和15%(110kda)。［结论］ ds对人胃癌细胞mkn1黏附过程的抑制与整合素β1蛋白表达的减少有关。
【关键词】 胃肿瘤
the mechanism of dextran sulfate inhibiting cells’ adhesion and integrin β1 expression in human gastric cancer cell line
xu yuan-yi1, huang yun-ning2, wang wei2, et al.
（1.department of pathology, ningxia medical college, yinchuan 750004, china;
2.ningxia people’s hospital, yinchuan 750021, china）
abstract: ［purpose］ to explore mechanism of the adhesion of human gastric cancer mkn1 cells inhibited by destran sulfate(ds). ［methods］ mkn1 cells were cultured with ds or pbs, then stained with immunofluorescent cytochemistry and observed in fixed or living conditions by confocal laser scanning microscope. western blot was used to analyze the protein expression of mkn1 cells. ［results］ mkn1 cells formed filopodia and adhered to other cells to form a cell-monolayer. integrin β1 intensively expressed in the cell membrane and formed clusters. ds-treated cells tended to maintain a round shape by contracting the filopodia. ds inhibited the expression of integrin β1 and decreased the area of integrin β1 clusters. mkn1 cells expressed two forms of integrin β1(130kda and 110kda). both forms of integrin β1 protein expression of the attaching cells in the experimental group decreased to 64%(130kda) and 57% (110kda) of those in the control group, the integrin β1 protein expression of the floating cells in the experimental group decreased to 51%(130kda) and 15%(110kda) of that in the control group. ［conclusion］ ds inhibiting mkn1 cells’ adhesion is related to decrease of integrin β1 expression.
key words: dextran sulfate; gastric neoplasms; integrin β1
胃癌腹膜种植转移的机制尚不十分清楚。Www.11665.CoM一般认为癌细胞浸润胃壁浆膜层并脱离癌组织母体进入腹腔，成为有生物活性的脱落癌细胞，黏附于腹膜并增殖形成种植转移灶[1]。在这过程中细胞黏附是一个重要环节。临床研究证明胃癌患者整合素β1表达的增强与癌的转移和腹腔种植有关[2]。近来研究表明硫酸右旋糖苷(ds)具有抗恶性肿瘤细胞黏附的作用[3]。本实验对使用ds后胃癌mkn1细胞黏附和整合素β1的表达和调节进行了研究，为寻找新的肿瘤治疗方法提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
细胞：人胃癌mkn1细胞株购自日本癌研究资源库。细胞保存在含有10%小牛血清(fbs)的rpmi-1640培养液中，在37℃，5%co2的条件下培养。
药物：将硫酸右旋糖苷（分子量500 000）以2%浓度溶于磷酸缓冲液(pbs)中，用22μｍ的过滤器灭菌。实验组ds的最终浓度为0.4%，对照组用相同容量的pbs代替ds。
抗体：本实验使用羊抗人单克隆抗体，fitc标记的抗整合素β1抗体。兔抗羊复合alexa flour 546 igg和兔抗羊igg。
1．2 方 法
相差显微镜观察：将细胞(5×104细胞/孔) 培养于75ml培养盘中，设ds实验组和pbs对照组。4h时后在位相差显微镜下观察。实验观察到实验组有大量细胞呈游离状态，其成活率高于90%，遂收集游离细胞用于蛋白测定。同时用0.25%的胰酶分离贴壁细胞用于蛋白测定。
荧光免疫细胞染色：置mkn1细胞于单左旋赖氨酸(pll)包被的35mm玻璃底面培养盘中，用含有ds或 pbs的培养液培养。培养时间2h。用pbs冲洗后用4%福尔马林/pbs在37℃下固定15min，然后与抗整合素β1单克隆抗体反应，4℃，12h，抗体浓度为1∶100。用pbs反复冲洗后，在暗处与兔抗羊复合alexa flour 546 igg（1/1 000）反应2h。用共聚焦显微镜(德国产lsm 510)对标记后的细胞进行观察。
活细胞整合素β1的荧光免疫染色：将细胞培养于含有fitc标记的抗整合素β1抗体（1/50）的0.2% 牛血清蛋白（bsa）/pba中90min。用pbs洗3次后，将细胞置于pll包被的35mm玻璃底面培养盘中，用含有10%fbs的培养液培养。将培养盘置于共聚焦显微镜观察盒中，在37℃，5%co2条件下进行观察；并于培养后2h后向观察盒中加入ds，使ds的最终浓度为0.4%，然后分别于加入ds 30min和60min后对同一细胞进行观察。
整合素β1蛋白表达的水平：用western blotting法测定整合素β1蛋白表达的水平。细胞培养4h后，分别用0.02%edta分离试验组和对照组的贴壁细胞,并收集试验组的游离细胞，常规进行蛋白电泳和膜转入。在进行一次抗体反应(1∶200，4℃，12h)后进行二次抗体反应(1∶1，１h)，再与过氧化酶标记的链球菌抗生物素蛋白(1∶1) 反应１h。用增强的蛋白反应系统探测免疫反应带。反应带显色于柯达胶片后，将胶片置于es2000扫描仪中扫描并将图像经power mac photoshop6.0软件转送至nih-image 1.62软件中。使用nih-image gel macro工具对反应带的面积和密度进行测定并计算试验组的游离细胞，试验组的贴壁细胞与对照组的贴壁细胞之间整合素β1蛋白表达水平的比例。
2 结 果
2.1 位相差显微镜观察
培养4h时后，对照组mkn1细胞呈纺锤形或扁平形，细胞间相互接触形成单细胞层。实验组有大量细胞处于游离状态，多数贴壁细胞保持圆形状态，很少见到细胞间的连接。见图1。
2.2 荧光免疫细胞染色
培养2h时后，对照组(图2a)mkn1细胞在细胞膜上表达整合素β；整合素β1在细胞的底面形成散在的集落，细胞间以伪足相连，伪足上有强烈整合素β1的表达；实验组(图2b)细胞膜表达整合素β1，但不形成整合素β1集落。
2.3 活细胞整合素β1的免疫荧光染色
被置入培养盘后，细胞形成伪足并附着于培养盘上。培养2h后，在细胞的底面可以看到大区域的整合素β1集落团块（图3a），细胞变成扁平形状并形成多个巨大伪足(图3a)，加入ds 30min和60min后，整合素β1集落团块的区域缩小(图3b, 图3c)，伪足随着时间的推移缩小变短或者消失（图3b，图3c）。
2.4 整合素β1蛋白表达的水平
整合素β1有饱和和非饱和两种形式，分子量分别为130kda和110kda。实验组和对照组mkn1细胞都表达了整合素β1的两种形式。经nih-image gel macro软件的测定，实验组贴壁细胞整合素β1蛋白表达的水平分别减少到对照组贴壁细胞的64%(130kda)和57%(110kda)，实验组游离细胞整合素β1蛋白的表达分别减少到对照组贴壁细胞的51%(130kda) 和15%(110kda)水平。
3 讨 论
细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必要条件。细胞在迁移过程开始是细胞极化，胞膜的出芽(伸出伪足)，细胞肌动蛋白收缩，细胞在黏附斑上移动，最后细胞尾部与基底的分离。整合素信号参与其中每个过程。整合素信号诱导细胞骨架组织改变和细胞收缩，促进细胞迁移。一些关于整合素集落的形成和转移的研究表明，整合素从细胞的后缘（尾部）转移到细胞的前方（头部），并在此形成新的黏附接触，在伪足顶部的整合素引发局部黏附的形成[4]。活性化的整合素β1通常形成具有特殊结构的集落团块与微丝形成连接，整合素在活性化的同时引发细胞内信号传递的瀑布式反应，从而导致细胞骨架的重组，引起细胞的形态学改变[5]。
整合素是一个跨膜蛋白大家族，由α和β两种亚基构成异二聚体。两种亚基在细胞表面以非共价健连接，都有较长的细胞外片段、跨膜片段和较短的细胞内片段。细胞外片段是黏附分子与其配体结合的部位；跨膜片段相对保守，但近膜区域侧变异多样，多数细胞因子及其他可溶性调节因子通过与此作用而调节整合素的功能；细胞内片段较短，形态多样，直接或间接与细胞骨架蛋白连接可引起细胞的形态变化；也可直接或间接与连接蛋白结合而激活胞内酶链系统，引起信号转导。整合素信号通过黏着斑激酶(focal adhesion kinase，fak)和生长因子受体黏合蛋白2(growth factor receptor binding protein 2，grb2)激活，经肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，mlck)使肌球蛋白轻链(myosin light chain，mlc)磷酸化增加，使细胞收缩、迁移。整合素的激活可促进新的黏附斑形成，使黏附蛋白和细胞骨架组织磷酸化和细胞迁移。细胞运动时尾部整合素黏附能力的下调，伴随着黏附斑的解离。
整合素的配体为细胞外基质成分，如纤维黏连蛋白(fibronectin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、胶原蛋白(collagen)、体外黏连蛋白(vitronectin)、层黏蛋白(1aminin)等，参与介导细胞与细胞外基质间相互作用，促进细胞固着和形成新组织。在胃癌细胞离开瘤母体，侵袭到腹膜的基底膜这一异质黏附过程中，整合素β1起关键作用。
越来越多的研究证明，整合素在肿瘤发生早期发挥的作用为降低肿瘤化的细胞与周围细胞之间的粘附，促进肿瘤细胞与周围细胞的脱离，从而有利于瘤细胞进入血液。而当瘤细胞到达机体的非原发瘤的部位时，整合素发挥相反的作用，此时促进瘤细胞与ecm及侵袭部位正常组织的黏附，从而有利于瘤细胞在此组织的定位，达到肿瘤转移的目的[6]。
在转移过程中，癌细胞伸出扁平伪足与ecm 黏附，同时使ecm分子之间的联系消失，从而使癌细胞前行。扁平伪足的伸出被肌动蛋白聚合作用所诱导，被膜压力的局限性降低所促进[7]。在本实验中，细胞被置入培养盘后，在底部迅速形成伪足与培养盘相接触，然后伪足逐渐增大，细胞变形成扁平状，与培养盘的接触面积增大，使细胞牢固黏附在其上，单靠物理作用不能使其从盘壁上脱落。
在本实验中，将mkn1细胞悬液置入培养盘后，对照组多数细胞很快贴壁，实验组很多细胞保持游离状态。这表明ds抑制了mkn1细胞的黏附活动，使其不能很快贴壁。
本实验观察到两种现象。一是ds在质和量上抑制整合素β1的表达。荧光免疫染色表明ds抑制整合素β1的表达并减少整合素集落区域。western blotting分析结果表明在使用ds后，附着mkn1细胞整合素β1的蛋白表达水平减少到对照组的60%~70%，而游离mkn1细胞整合素β1蛋白表达的水平则减少到对照组的15%~50%。二是ds阻止了mkn1细胞通过形成伪足和改变形状而达到形态上的稳定。在细胞贴壁前使用ds时，许多细胞不能贴壁，而多数贴壁细胞也保持圆形形状。同时对照组的附着细胞则改变形状呈扁平状，而此形态使细胞达到力学上的稳定。在细胞贴壁后使用ds时，细胞的伪足变短或者消失，已变成扁平形状的细胞表现出恢复圆形形状的趋势。在这个过程中，整合素β1的集落区域减少，尤其是在伪足部分不能形成整合素集落。本实验的结果表明，ds抑制mkn1细胞在培养盘上的黏附可能与抑制整合素β1的活性化，阻止细胞骨架的重组有关。由于细胞的形态改变受阻，肿瘤细胞不能黏附于腹膜上，即不能完成种植转移过程，如果辅以其他治疗有可能杀死处于游离状态的肿瘤细胞。在体外实验中，ds有效地抑制了胃癌mkn1细胞的黏附过程，证明了ds的抗肿瘤转移作用。本实验为以后关于ds的抗肿瘤转移的研究提供了依据和线索。
【参考文献】
[1] yonemura y, bandou e, kawamura t, et al. quantitative prognostic indicators of peritoneal dissemination of gastric cancer[j]. eur j surg oncol, 2006, 32(6):602-606.
[2] ke jj,shao qs, ling zq. expression of e-selectin, integrin beta1 and immunoglobulin superfamily member in human gastric carcinoma cells and its clinicopathologic significance[j]. world j gastroenterol, 2006, 12(22):3609-3611.
