【摘要】 目的 本研究拟寻找鉴定结肠癌自身抗体谱，研究这些自身抗体作为结肠癌诊断候选血清标志物的可能性，同时鉴定这些自身抗体的抗原为研究结肠癌发生、发展相关的基因提供线索。方法 用结肠癌组织建立了库容量达5×105pfu的cdna表达文库，用结肠癌患者血清进行了文库血清学分析（serex），筛选获得了阳性抗原克隆，进一步分析了其中4个克隆与30例结肠癌和30例正常人血清的反应情况。结果 获得的33个阳性克隆中，31个剪切成功，2个克隆与已知est序列明显无同源性，另外29个克隆与已知基因高度同源。uracildna glycosylase等4个抗原克隆与结肠癌患者和正常人血清反应阳性率分别为76%（23%）、80%（6%）、77%（0）、73%（66%）。结论 本研究发现的29个结肠癌抗原可能参与了结肠癌的发生发展，可能作为结肠癌的治疗潜在分子靶点和结肠癌诊断新的候选血清学标志物。uracildna glycosylase等3个克隆与结肠癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清，其相关自身抗体可作为结肠癌诊断的血清标志物。
【关键词】 结肠癌 肿瘤抗原 自身抗体 cdna表达文库 血清标志物
结肠癌是在欧美国家发病率位居第二的癌症，在我国结肠癌的发病率目前排第五位。近年来，其发病率还在逐年上升。目前早期结肠癌的诊断率仍很低，约1/4的患者在初次确诊时已有远处转移，其中50%是肝转移。wwW.11665.Com最新的肿瘤免疫学研究认为，病人可对自身肿瘤抗原产生体液免疫应答[1]。正常细胞向癌细胞转化过程中，突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反应，在肿瘤患者血清中可以检测到肿瘤相关抗原的自身抗体谱[2]。进一步的研究发现在肿瘤患者和正常人的血清中肿瘤自身抗体谱存在显著差异[3]，提示自身抗体谱有可能作为肿瘤早期诊断的新型血清标志物。基于这个理论，我们构建患者结肠癌组织的cdna表达文库，筛选了结肠癌相关自身抗体谱，并探讨将其作为结肠癌早诊的血清学标志物的可能。
1 资料和方法
1.1 资料
结肠癌组织来自中国医学科学院肿瘤医院收治的1例男性结肠癌患者，病理诊断为低分化型腺癌，肝多发转移，淋巴结转移6/18，为本院腹部外科手术切除，手术同时取该病人血清。其他30例结肠癌术前病人血清来自本院检验科。手术获取的癌组织和患者血清及30例健康正常自愿者的血清采集后立即冻于-80℃备用。
1.2 方法
1.2.1 结肠癌组织mrna的提取 取结肠癌组织500mg，照mrna提取试剂盒mrna polyattract system 1000的说明书进行。提取mrna溶于无rnase去离子水，测a260/280值，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取6μg mrna用于cdna文库的构建。
1.2.2 cdna表达文库的构建 cdna表达文库的构建使用stratagene公司提供的zapcdna library construction kit。 第一链cdna合成使用thermoscript rt 高温逆转录酶（invitrogen），其余参照建库试剂盒说明书进行。文库4℃保存，筛选之前不扩增。
1.2.3 大肠杆菌/噬菌体裂解液与cnbrsepharose 4b柱料的偶联 取600μl大肠杆菌液加入7×103pfu的λzap空载噬菌体，37℃孵育15min后加入8ml nzy/琼脂糖顶层胶，混匀后铺于18cm直径的含有nzy/agar底层胶的平板上，37℃扩增培养过夜。然后于平板中加入10ml偶联缓冲液（0.1mol/l nahco3, ph8.3），4℃振荡洗脱16h。收集洗脱液，超声破碎未完全裂解的大肠杆菌。经紫外分光光度法进行蛋白定量。偶联的过程基本按照amersham公司提供的说明书进行。偶联后用含有0.02%叠氮钠的tbs平衡凝胶介质，4℃保存待用。
1.2.4 血清标本的吸收 患者血清对文库进行免疫学筛选之前或用阳性克隆与异体血清反应前，必须排除血清中存在的与细菌和噬菌体反应的抗体。采用上述偶联的cnbrsepharose 4b柱料对血清进行预吸收。去除血清中与大肠杆菌/噬菌体蛋白反应的抗体成分。用含有1% bsa的1×tbs 1∶10稀释血清后，按照1∶1的体积比与偶联了大肠杆菌/噬菌体裂解蛋白的柱料混合，4℃轻度振荡过夜，收集血清。血清重复吸收3次。收集吸收后的血清，用含有1%bsa的1×tbs以最终1∶50的稀释度稀释血清，加入0.02%的叠氮钠防腐，4℃保存备用。
1.2.5 cdna文库的筛选 取600μl xl1bluemrf'菌液加入7×103pfu的重组噬菌体，37℃孵育15min后加入8ml nzy/琼脂糖顶层胶，混合后铺于18cm直径的含有nzy/agar底层胶的平板上，37℃扩增培养至噬斑刚刚可见时，转印至经10mm iptg浸泡的硝酸纤维素膜上37℃诱导表达8h。将平板移至4℃，放置2h。硝酸纤维素膜与1∶50稀释的自体血清室温反应2h，用tbs/t洗涤5次，然后与1∶2500 稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人igg（sigma）二抗室温孵育1h。用tbs/t缓冲液洗涤5次，最后1次换用tbs，加入至配制好的nbt/bcip底物液中，暗室内显色。与阳性显色斑对应的噬斑即为cdna文库第一轮筛选的阳性噬菌体克隆。将第一轮筛选得到的阳性克隆混合后进行第二轮筛选，但是同一个平板铺两张膜，一张与患者自体的血清反应，另一张则直接与羊抗人iggap反应，两张膜同时显色。那些与自体血清反应阳性而直接与羊抗人iggap二抗反应阴性的噬斑为文库第二次筛选的阳性克隆。
1.2.6 阳性克隆的内部剪切 按stratagene公司提供的说明书将含有插入序列的质粒转化为单链丝状噬菌体形式存在的pbluescript噬菌粒。噬菌粒感染solr菌后，用于碱裂解法小量提取质粒，以ecor i和xho i进行双酶切，初步鉴定插入片段的大小。
1.2.7 核苷酸序列测定及生物信息学分析 测序由上海博亚公司完成。将测序所得核苷酸序列在各种核苷酸数据库（ncbi genback database）中进行分析，主要包括核苷酸序列同源性分析、读码框分析等。
1.2.8 异体血清与抗原克隆反应 用上述偶联的cnbrsepharose 4b柱料吸收过的30例结肠癌病人及30例正常人的血清，在预先用1% bsa封闭的24孔培养板中进行操作。将选定的阳性克隆噬菌体分别铺于平板中，保证每平方厘米有3～5个噬斑。待噬斑刚刚可见时，用裁剪为1cm×1cm小片并用10mm iptg浸湿并晾干的硝酸纤维素膜贴在上，保证每片有3～5个噬斑，诱导表达。揭膜后，pbs洗涤再于24孔培养板中用1% bsa封闭带有噬菌斑的硝酸纤维素膜，每一片膜与一例用1% bsa/pbs/t进行1∶100稀释的血清反应。之后与cdna文库筛选操作相同。
1.3 统计学方法
统计各个阳性克隆在正常人及结肠癌病人血清中的抗体阳性率，用χ2检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 构建库容为5×105pfu的人结肠癌cdna表达文库
共提取mrna 10μg, od260∶od280值为2.05, 说明其纯度较高，1%琼脂糖凝胶电泳显示其为从9.4～0.5kb的弥散，主要集中于1.5～2.0kb左右，表明提取的mrna质量较好，没有明显的降解。以提取的5μg结肠癌组织mrna为模板，在合成cdna第一链和第二链的同时随机掺入32p 。电泳后放射自显影显示，第一链为介于9.0～0.5kb的弥散，大部分集中于1.5～2.0kb左右,无明显的条带；cdna第二链的范围比第一链稍大，为介于10.0～0.5kb的弥散，大部分集中于1.5～2.0kb左右，也无明显的条带。结果表明，利用高温反转录酶成功地对mrna进行了反转录，合成的cdna第一链涵盖了绝大多数的mrna分子，造成随后合成的第二链同样涵盖了绝大多数的mrna分子。取100ng cdna与zap express载体连接后，用gigapackⅲ gold cloning kit提供的包装蛋白进行包装。获得库容为5×105pfu的结肠癌组织cdna表达原始文库。文库不经扩增直接用于抗原筛选。
2.2 从结肠癌组织cdna表达文库中筛选出了33个与患者血清反应的克隆
a：第一轮筛选；b：第二轮筛选。实心箭头所示为第一、
二轮筛选的阳性克隆，空心箭头为在第一轮筛选中呈阳性
而在第二轮筛选中呈阴性的克隆
图1 文库血清学筛选得到的阳性克隆
利用上述偶联的cnbrsepharose 4b柱料吸收后的结肠癌患者自体血清筛选了总共5×106的克隆。初筛共获得了89个阳性克隆。图1a是一张经初筛得到的阳性克隆在硝酸纤维素膜上的显色情况。将得到的89个克隆混合培养后重新转印到新的膜上进行第二轮筛选，并排除自身igg反应的克隆，即排除那些能直接与抗人igg的二抗反应的克隆。图1b是经过第二轮筛选后阳性克隆在膜上显色的一张代表图。经过第二轮筛选共得到33个阳性克隆。
2.3 同源性分析阳性克隆基因代表29 个不同基因
对获得的33个阳性克隆首先进行内部剪切。用ecor i和xho i双酶切鉴定外源插入片段的大小。其中31个阳性克隆剪切成功，片段大小在0.5～2.0kb之间。将这些克隆进行核苷酸序列测定。核苷酸序列显示31个克隆代表不同的抗原分子。进入genbank进行est同源性比较发现，有29个克隆与genbank已有的est具有较高的同源性，如表1所示。余下2个克隆的序列与genbank已报道的est或基因的外显子序列无明显同源。表1 部分结肠癌cdna表达文库的阳性克隆的同源性分析
克隆号基因名称c1uracildna glycosylasec2hlaa2c3human transmembrane protein tyrosine phosphatase homologuec4product of mitochondrion dnac5 peroxisomal farnesylated proteinc6human transforming growth factor beta stimulated protein clone 22c7cytochrome c oxidase submit vibc8human ribosomal protein l11c9human gpiarchored protein p137c10human dbp blike proteinc11human hypothetical protein loc51321c12human hypothetical protein flj20348c13human ganp proteinc14human apex nuclease multifunctional dna repair enzymec15human ribosomal protein l23a
2.4 阳性克隆与正常人血清反应性明显低于结肠癌患者
我们检测了4个阳性克隆与30例结肠癌患者血清和30例正常人血清的反应情况。图2是c1克隆与5例结肠癌和5例正常人血清的反应情况。c1克隆与肿瘤患者的血清反应明显强于正常人血清。c1、c29、c21克隆在正常人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高均大于77%，见表2，χ2检验结果显示有显著性差异（p<0.01），提示其有可能成为结肠癌早期诊断的血清学标志物。c14与正常人和结肠癌患者血清的反应性相似。以c1、c29、c21三个克隆中任意一个阳性为诊断标准，则对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性分别达90%和70%。如果以c1、c29、c21三个克隆中任意两个阳性为诊断标准，则对上述30例癌和30例正常的诊断特异性和敏感性分别达80%和100%。
a：肿瘤血清；b：正常血清
图2 c1克隆与5例结肠癌阳性反应和
与5例正常人血清阴性反应
表2 c1、c29、c21、c14与正常人及结肠癌
病人血清反应的阳性率
克隆号正常血清阳性率病人血清阳性率卡方检验c123%(7/30)76%(23/30)p<0.01c296%(2/30)80%(24/30)p<0.01c210%(0/30)77%(23/30)p<0.01c1466%(20/30)73%(22/30)p>0.05
3 讨论
在过去的20多年中，越来越多的证据显示机体对自身肿瘤的成分也能产生体液免疫反应[3，4]，特别是近年来采用serex技术对多种肿瘤患者的体液免疫反应进行分析[57]，发现了许多肿瘤患者血液中都存在与肿瘤细胞成分特别是胞内成分蛋白反应的“肿瘤自身抗体”。这些在恶性肿瘤病人血液中以较高频度出现的自身抗体一般是非专一性的，综合反映了异常的肿瘤发生发展过程中的机体体液免疫状态[3]。
本研究采用serex技术对结肠癌肿瘤自身抗体谱进行了研究，获得了31例阳性克隆，代表了31种结肠癌肿瘤自身抗体。其中有两个克隆与已知的est和人的dna外显子序列无明显同源，有报道这些序列表达的肽段可能是模拟了某些抗原分子的表位而被肿瘤自身抗体所识别[8]。其余29例阳性克隆包括人线粒体基因，自身抗原，分子伴侣，dna修复酶，细胞膜表面蛋白，核糖体蛋白及一些目前功能尚未确定的基因等，其中既有发生了点突变及缺失的基因，也有未发生突变的基因。 比如，c3是人跨膜蛋白酪氨酸激酶同源蛋白, i型糖尿病自身抗原，属于癌症非依赖性自身抗原。c4、c22、c21、c23、c27均为人线粒体基因组片段，c8、c15均为核糖体蛋白，应属于癌症相关自身抗原，其在正常组织及肿瘤组织均有表达，在肿瘤坏死时被暴露出来，从而被免疫系统所识别，发生体液免疫应答。其中c1，尿嘧啶dna糖基化酶，主要参与dna复制时错配的修复；c14人apex核酸酶(多功能dna修复酶)基因；二者都参与dna的复制及修复。这些抗原基因是通过何种机制诱发肿瘤患者产生自身抗体，它们又是如何参与结肠癌的发生发展的呢？这仍需一步的研究。
肿瘤自身抗体谱作为肿瘤血清诊断的新型标志物的应用前景和价值已逐渐被学界认可，这一领域的研究已逐渐成为肿瘤血清诊断的新型标志物研究的热点。2005年，wang等[8]报道他们通过类似的方法得到的22个前列腺癌抗原对于前列腺癌的诊断的敏感性达到了81.6%，特异性达到了88.2%，明显高于psa诊断的结果。他们的这一研究被新英格兰医学杂志评为近年来分子诊断标志物的最重要的进展[9]。2006年的一项最新研究报道也显示，蛋白芯片检测自身抗体谱技术可以提前于临床诊断5年发现约80%的处于“癌前”阶段的患者，证明该技术在癌前病变的筛查中也具有非常重要的作用[10]。本研究对新发现4个结肠癌自身抗体作为结肠癌血清标志物的潜能进行了研究。结果发现：c1、c29、c21在正常人血清中抗体阳性率较低，均小于23%，而在结肠癌病人血清中抗体阳性率较高，均大于77%, χ2检验结果显示有显著性差异（p<0.01）。应用多个分子标志物联合诊断肿瘤已经成为学界共识。我们应用这三个标志物联合分析也明显地提高了诊断的敏感性和特异性，说明其能够成为结肠癌早期诊断的血清学标志物。我们也对这4个自身抗体与结肠癌的不同临床分期和分化类型的相关性进行了分析。结果未发现有明显的相关性。我们认为这可能是由于我们所用的病例数太少的原因。
总之，我们的研究分离得到了结肠癌相关肿瘤抗原。这些结肠癌相关肿瘤抗原可能参与了结肠癌的发生发展，同时也可能成为结肠癌诊断的血清学分子标志物。
【参考文献】
[1]houghton an, guevara-patino ja. immune recognition of self in immunity against cancer[j]. j clin invest,2004,114(4):551559.
[2] fernandezmadrid f, tang n, alansari h, et al. autoantibodies to annexin xia and other autoantigens in the diagnosis of breast cancer[j]. cancer res,2004,64(15):50895096.
[3] coronella ja, hersh em. naturally occurring bcell responses to breast cancer[j]. cancer immunol immunother,2003,52(12):715738.
[4] 吴晓江, 王歈, 季加孚. 胃癌中肿瘤/睾丸抗原的表达研究及nyeso1蛋白的自身抗体检测[j].北京大学学报,2005, 37(3):252256.
[5] krebs p, kurrer mo, kremer m, et al. molecular mapping of autoimmune b cell responses in experimental myocarditis[j]. j autoimmun, 2007,28(4):224233.
[6]türeci o, usener d, schneider s, et al. identification of tumorassociated autoantigens with serex [j]. methods mol
