【摘要】 目的 分析stat3及其靶基因产物cyclin d1与caspase3在卵巢癌组织中的表达情况，探讨stat3及其靶基因产物在卵巢癌发病机制中的作用。方法 收集经手术切除的卵巢癌标本40例，应用western blot检测40例卵巢癌组织、正常卵巢组织中stat3及其靶基因产物cyclin d1与caspase3表达。结果 pstat3、cyclin d1与caspase3表达水平在卵巢癌组织中明显高于正常组织（肿瘤vs 正常，p=0.028，0.035， 0.047）；pstat3与cyclin d1表达水平与figo分期相关（p=0.026,p=0.041）。pstat3及cyclin d1在卵巢癌组织中表达情况呈线性相关（r=0.412,p<0.05）。结论 stat3信号转导通路可能在卵巢癌发生过程中起重要作用，检测卵巢癌中stat3及其靶基因产物的表达可以反映肿瘤的恶性潜能。
【关键词】 卵巢癌；信号转导；增殖；凋亡
constitutive activation of stat3 pathway and overexpression of target gene products correlate with malignant potential in human ovarian carcinoma
hou tao1, zhang ying1, ma xiangtao2, fu jing3
1.department of obstetrics and gynecology, beijing haidian hospital, beijing 100080, china,2.department of surgery, 3.department of pathologyabstract：objective the purpose of this study was conducted to investigate the expression of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) and target gene products including cyclin d1 and caspase3 in human ovarian carcinoma tissues, and to explore the mechanisms in tumorigenesis of ovarian carcinoma. methods primary ovarian cancers and normal ovarian tissue were obtained from 40 patients undergoing ovarian cancer resection. western blot analysis was used to measure the expression of stat3, pstat3, cyclin d1, and caspase3 in cancerous tissues, normal ovarian tissues. results pstat3, cyclin d1, and caspase3 protein levels were increased in ovarian cancer compared with adjacent normal tissue (p=0.028,0.035,0.047). overexpression of pstat3 and cyclin d1 were correlated with figo stage in ovarian cancer (p=0.026,0.041). it was found that cyclin d1 was in a positive linear correlation fashion with pstat3 in tumor (r=0.412,p<0.05). conclusion these findings provide evidence that stat3 signaling pathway may play an important role in the tumorigenesis of ovarian carcinoma, and detecting the expression of stat3 and its target gene products may predict the malignant potential of ovarian carcinoma.
key words：ovarian neoplasm; signal transduction; proliferation; apoptosis
stat3是转录信号转导子与激活子家族（signal transducers and activators of transcription，stats）的重要成员，该通路接受生长因子、细胞因子等细胞外信号刺激，作用于细胞核内特异的dna片段，调控靶基因转录，影响细胞的增殖、分化和凋亡[1]。wWW.11665.coMstat3异常激活与多种恶性肿瘤发生发展及预后密切相关，但是关于stat3信号转导通路及其靶基因产物与卵巢癌的研究尚处于初期[2]。本研究应用western blot检测stat3（pstat3）及其靶基因产物cyclin d1与caspase3在卵巢癌组织中的表达，分析stat3及其靶基因产物与卵巢癌恶性潜能的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
western blot中用的pvdf膜购自millipore公司，显影用的胶片购自柯达公司。本研究中所有抗体购自santa cruz公司。预染标准分子量蛋白购自gibco/brl公司。ecl化学发光试剂盒来自amersham公司。浓缩蛋白分析液来自biorad公司。研究中所涉及的其他试剂均为分子生物学纯度购自sigma公司。
1.2 患者资料与组织标本
收集北京海淀医院妇产科2000年12月～2006年12月经手术切除的卵巢癌标本40例，年龄33～69岁，中位年龄48岁；术后病理分级：包括g1 14例，g2 11例，g3 15例；肿瘤分期按照国际妇产科联盟（figo）分期，分为ⅰ期8例、ⅱ期7例、ⅲ期21例、ⅳ期4例。所有病例均行肿瘤细胞减灭术，于手术切除肿瘤后15～20min内采集卵巢癌组织，正常卵巢组织为对照（来源于同时期病理证实卵巢良性病变患者），立即置于液氮中保存。患者在手术前未接受化疗或者放疗并且签署知情同意书。
1.3 研究方法
1.3.1 组织蛋白提取
组织于裂解缓冲液中裂解（150mmol/l 氯化钠; 1% 过氧胆酸钠; 1% triniton x100; 0.1%十二烷基磺酸钠; 10mm tris, ph 7.2; 1mmol/l 正钒酸钠; 1mmol/l苯甲磺酰氟; 1mmol/l 氟化钠; 0.1mmol/l抑肽酶, 1mmol/l亮抑蛋白酶肽）。裂解液在4℃条件下13 000r/min离心30min[3]。
1.3.2 蛋白浓度测定方法（bradford法）
以牛血清蛋白（bsa）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国biorad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。
1.3.3 western blot
在进行western blot之前将蛋白提取物与2×十二烷基磺酸钠（sds）上样缓冲液按1∶1混合（125mmol/l trishcl, ph6.8; 4%十二烷基磺酸钠; 20% 甘油; 10% 2巯基乙醇）后100℃水浴下加热5min。取总蛋白50μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到pvdf膜上。电泳时在聚丙烯酰胺凝胶中加入预染标准分子量蛋白作为指示。转膜后用tbst 缓冲液（10mmol/l tris .hcl，ph 7.5，150mmol/l 氯化钠，0.5% tween20）与5% 牛血清白蛋白封闭 30min 。封闭后，加入一抗stat3、pstat3、cyclin d1、caspase3，工作浓度1∶1 000，gapdh作为内参照，于4℃条件下孵育过夜，用tbst（每次5min）洗膜后，与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育30min，工作浓度1∶1 000。然后用ecl化学发光试剂盒检测杂交信号[4]。
1.3.4 吸光度测定
用phospho imager图像分析仪（美国molecular dynamics公司）测定条带的吸光度（a值），以a值代表蛋白的相对表达量。
1.3.5 免疫组织化学法
组织标本在4%的福尔马林中固定，用石蜡包埋。卵巢癌与正常卵巢组织切成5μm 厚，附着于载玻片上，在空气中干燥，然后在烤箱中60℃加热2h。切片于二甲苯中脱腊后经梯度乙醇水化，用0.3%的过氧化氢甲醇溶液抑制内源性过氧化物酶。下面进行抗原修复：切片在10mm枸橼酸缓冲液(ph 6.0)中加热10min后，用pbs（ph7.4）缓冲液清洗并使切片冷却，然后将切片与5%的血清在湿盒内室温下孵育30min阻断非特异结合位点。切片在4℃条件下与一抗stat3与pstat3孵育过夜，稀释比1∶100。dab显色，苏木素复染，阴性对照中用tbs替换一抗。
1.3.6 统计学方法
应用spss 12.0软件完成，psata3、cyclin d1、caspase3与各种临床病理特征的关系用t检验分析，相关性用pearson分析，p值小于0.05时为差异有统计学意义。
2 结果
卵巢癌组织中pstat3, cyclin d1及caspase3蛋白表达水平明显高于正常卵巢组织（肿瘤vs 正常，p=0.028，0.035，0.047）,见图1。卵巢癌组织中pstat3与cyclin d1表达水平与figo分期相关（p<0.05）。pearson相关性分析显示pstat3与cyclin d1在卵巢癌组织中表达情况呈线性相关（r=0.412，p<0.05），而pstat3与caspase3在卵巢癌组织中表达情况无相关性（r=0.127，p>0.05）。
t: 卵巢癌组织，n: 正常卵巢组织
图1 stat3通路成员在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达
3 讨论
jaks/stats信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切，该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化。哺乳动物中stats家族由7个成员组成：stat1～stat4，stat5a，stat5b及stat6。stat3作为stats通路的重要成员，其表达和活化与髓样白血病、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌以及胃肠道肿瘤密切相关[5, 6]。
stat3作为上游酪氨酸激酶通过调控靶基因而诱导某些关键产物的表达来影响肿瘤的发生，重要的靶基因产物包括cyclin d1与caspase家族成员。细胞周期素d1（cyclin d1）在细胞周期的调控中起重要作用，通常与细胞周期素依赖性激酶cdk4或cdk6结合，控制由g1期进入s期的过程。stats可以与cyclin d1启动子上特定结合位点结合，影响cyclin d1转录，调控细胞周期[7]。duan等[8]发现pstat3高表达卵巢癌细胞系中cyclin d1表达增高，而pstat3低表达细胞系中cyclin d1表达下降。胱冬肽酶（caspase）是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用。他们对bcl2家族的蛋白质具有重要的酶解修饰作用，目前已发现的属于这类蛋白酶家族的成员已有十余种，包括caspase 1～10等，而caspase3是此家族的重要成员[9]。本研究发现pstat3、cyclin d1与figo分期晚相关（p<0.05），pearson相关性分析显示pstat3与cyclin d1在卵巢癌组织中表达情况呈线性相关（r=0.482，p<0.05），而pstat3与caspase3在卵巢癌组织中表达情况无相关性（r=0.127，p>0.05），其可能机制是失活状态的stat3不能与cyclin d1启动子结合，从而抑制cyclin d1表达，抑制细胞增殖。
总之，stat3信号转导通路在卵巢癌中的转录调控机制尚不清楚，stat3异常激活与卵巢癌凋亡关系还有待于进一步明确。实验动物模型及临床观察中发现肿瘤细胞耐受化疗与stat3与caspase成员异常增高有关，阻断stat3通路可诱导耐药肿瘤细胞凋亡[8]。深入研究stat3信号转导通路作用机制有可能为治疗卵巢癌提供理论与实验基础[9, 10]。
【参考文献】
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[3] 马向涛, 余力伟, 王杉, 等. stat3信号转导通路调控bcl2成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机制[j]. 肿瘤防治研究, 2007, 34(3):182184.
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