【摘要】 目的 探讨il15水平及其受体在儿童急性白血病中的表达及作用。方法 取确诊未治的儿童急性淋巴细胞白血病（all）、儿童急性非淋巴细胞白血病（anll）和非白血病组儿童各20例，20例正常儿童的血清，测定不同组别对象血清il15的水平和不同组别对象的骨髓单个核细胞il15受体三个亚基α、β、γ的表达并进行半定量分析。结果 急性白血病患儿血清il15水平较正常和对照组均出现明显下降；il15受体α、β、γ亚基的表达水平也均较正常组和对照组明显下降，但all与anll组之间和非白血病组与对照组之间差异无统计学意义。结论 急性白血病患儿无论血清il15水平及其骨髓单个核细胞il15受体α、β、γ均出现下降。
【关键词】 急性白血病；白细胞介素15；受体；基因
levels of interleukin15 and its receptor subunit expression in children acute leukemia
ye zhonglv1, chen mingzhen1, chen riling1,huang xiulan1,pang weijun2, chen shuiwen3
1.department of pediatrics, affiliated hospital of guangdong medical college,zhanjiang 524001,china;2.department of laboratory；3.maternal and child health hospital, baoan district, shen zhen
corresponding author：chen mingzhen, email: chenminzhen @tom.comabstract：objective to investigate the expression of il15 and its receptor in children acute leukemia, contribute to understand their function on acute leukemia. methods every group of acute lymphocytic leukemia(all),acute myeloid leukemia (anll) or nonleukemia group had 20 children who did not receive any treatment. the expression of the interleukin15 receptor alpha,beta,gamma mrna in bone marrow were examined by rtpcr, and make an semiquantitative analysis. the level of il15 in serum of every group by means of elisa.results the level of il15 in al（all and anll）group， were significant was assayed in statistics（p<0.05）with healthy children and nonleukemia group .the difference which the il15 level of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglected in statistics（p>0.05）.the expression of il15r alpha，beta，gamma mrna in al is significantly different than that of healthy and nonleukemia children.the difference which the il15 alpha，beta，gamma of all compared with anll or the level of healthy children compared with nonleukemia group is neglectable in statistics （p>0.05）. conclusion the il15 level of al children is lower than control group.and the expression that of il15rα,β,γ subunit in bone marrow mononuclear cell of al is smaller than those of nonleukemia group.
key words：acute leukemia; interleukin15; receptor；gene
免疫因素在白血病的发生发展中起着重要的作用，尤其是细胞免疫功能的变化，可能与白血病的发生密切相关；白细胞介素15(il15)是一种可溶性的淋巴细胞生长因子。WwW.11665.coM我们既往的研究发现，一定浓度的il15对骨髓增生异常综合征(mds) cd34＋造血细胞有刺激增殖分化和抑制凋亡的效果，其机制可能是与il15上调bcl2、bclxl凋亡抑制基因和caspase3的表达有关[14]。最近，我们通过检测部分白血病患儿及其健康儿童的血清il15水平及其受体表达情况，探讨它们在儿童急性白血病中的表达及作用，现报告如下。
1 资料和方法
1.1 临床资料
所有标本分别来自本院新确诊的病例和健康体检的儿童，均未经过任何细胞因子、激素或化学药物的治疗。分组：急性白血病组患儿40例，年龄4～16岁，其中男26例，女14例；包括急性淋巴细胞白血病(all)患儿20例，男12例、女8例；急性非淋巴细胞白血病(anll)患儿20例，男14例、女6例；诊断标准按张之南主编《血液病诊断及疗效标准》第二版[5]。非白血病组患儿20例，男13例，女7例，年龄在2～13岁，其中缺铁性贫血患儿10例、巨幼细胞性贫血患儿4例、葡萄糖6磷酸脱氢酶 (g6pd) 缺乏症缺乏患儿3例和地中海贫血的患儿3例。正常儿童对照组20例，年龄在4～10岁之间，其中男10例，女10例。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
抽取不同组别对象的外周血5ml，用离心机2 000g/min，离心5min，吸取血清转移到另一管，-20℃保存待测。同时抽取骨髓5～10ml，置含肝素的抗凝管中，充分混匀，即时分离单个核细胞，操作过程注意无菌。
1.2.2 il15测定
分离好的血清在常温下解冻20min，从4℃冰箱取出il15 elisa试剂盒在室温下放置20min，平衡至室温。其余的操作按试剂盒说明进行。
1.2.3 pbmc分离、总rna的提取、目的基因rtpcr扩增
（1）引物设计与合成
il15受体α、β、γ亚基基因的mrna从genbank中找出，引物根据primer软件设计，由上海生工生物工程技术服务合成。引物序列为：βactin：(528bp)上游5′ ctacaatgagctgcgtgtgg 3′，下游5′ aaggaaggctggaagagtgc 3′；il15rα：(203bp)上游5′ cacctatg aaa ctcggggaaac 3′，下游 5′ atgggaatgcggag aa cc 3′，il15rβ：(236bp)上游5′ gtgcgatggagggtgatg 3′，下游5′ cattcctgcttctgcttgag 3′，il15rγ: (428bp) 上游5′ cattggaagccgtggttatc 3′,下游5′ ggtgagtatgagacgcaggtg 3′。
（2）rtpcr
按qiagen公司的rtpcr一步法试剂盒说明书操作。其具体步骤为：先加入标本和试剂（冰上进行），然后于pcr仪上进行扩增，参数及条件如下：50℃ 30min,反应条件为94℃，预变性15min，34个循环：94℃变性45 s；50℃～68℃退火30 s；72℃延伸45 s；最后72℃延伸10min，总反应体积为25μl。其中α亚基的退火温度为53℃，β亚基的退火温度为53℃，γ亚基的退火温度为54℃，βactin的退火温度为55℃。α亚基的循环次数为31次，β亚基的循环次数为35次，γ亚基的循环次数为35次，βactin的循环次数为31次。
1.2.4 电泳和图像分析
取目的基因产物和内参产物混匀，于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果，并拍照图片，图片经扫描仪扫描后，用sigmascan 5.0图像分析软件进行光密度积分值分析，分别计算出检测基因与βactin (内参)的光密度值之比，作为其相对含量值。
1.3 统计学方法
计量资料用±s表示，使用spss11.５统计软件进行统计分析，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 白细胞介素15的水平
不同组别血清中白细胞介素15的水平检测，急性淋巴细胞白血病组的il15浓度为（34.37±2.8）pg/ml，急性非淋巴细胞白血病组的浓度为（29.61±3.2）pg/ml，正常对照组的浓度为（122.23±4.2）pg/ml，非白血病组的浓度为（117.54±3.9）pg/ml；其中all、anll组il15的浓度分别和正常对照组的浓度进行比较，p均<0.05，差异有统计学意义。all、anll组il15的浓度分别和非白血病组的浓度进行比较，p均<0.05，差异有统计学意义。all和anll组比较、正常对照组和非白血病组比较，p均>0.05，差异无统计学意义，见表1。表1 不同组别外周血清中il15浓度
2.2 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体α亚基基因表达
il15受体α亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是75％、75％、100％，α亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.4618±0.1460、0.4952±0.1271、0.8964±0.2130。all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0.05，有显著性差异。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图1。
2.3 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体β亚基基因表达
il15受体β亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80％、85％、100％，β亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5391±0.1740、0.5514±0.1961、0.8846±0.1310。all组、anll组的灰度扫描结果比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0 .05，差异有统计学意义。而且all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图2。
2.4 不同组别的骨髓单个核细胞的il15受体γ亚基基因表达
il15受体γ亚基条带在非白血病组最清晰，all组、anll组、非白血病组的表达率分别是80％、80％、100％，γ亚基表达的病例中灰度扫描结果比值分别为0.5104±0.1245、0.4997±0.1072、0.9062±0.2013。用all组、anll组灰度扫描结果的比值分别和非白血病组的比值进行比较，p均<0.05，有显著性差异。而且用all组灰度扫描结果的比值与anll组的比值进行比较，p>0.05，差异无统计学意义，见图3。
3 讨论
通过检测il15水平，结果all组、anll组血清il15的水平均较非白血病组和正常对照组低，但all和anll的血清il15水平差异无统计学意义，说明il15在急性白血病患儿中的表达水平要比正常儿童的低。由于il15具有一定的免疫介导作用，其水平下降，可能是导致急性白血病患儿免疫功能低下的原因之一，郭承吉等 [6]发现il2也存在类似现象。由于il15和il2有着广泛的同源性；是否急性白血病血清il15的水平也与病情及预后相关，而通过调节或刺激体内的细胞因子水平，是否可以达到一定的抗肿瘤作用[7]？因此，对白血病患儿的il15水平进行动态观察，可能有助于观察al的病情发展，判断预后及预测复发。
在atl疾病，人类t细胞白血病病毒ⅰ（htlvⅰ）感染的细胞其il15rαmrna表达显著升高，而且htlvⅰtax蛋白的表达可进一步使il15rαmrna水平升高，表明il15rα在atl细胞增殖中有一定的作用[8]。也有发现il15r高表达的白血病患儿其预后较好，生存期长，目前机制未明[9]；本课题用rtpcr方法从分子水平上检测骨髓中单个核细胞il15r亚基mrna的表达，检测显示：all组、anll组、非白血病组il15受体α亚基mrna的表达率分别是75％、75％、100％；β亚基mrna的表达率分别是80％、85％、100%；γ亚基mrna的表达率分别是80％、80％、100%，其中α亚基在bmmc的表达率未见有文献报道；β亚基表达率较文献[10]报道偏高，与文献[11]结果相似；而γ亚基的表达率和文献[11]报道基本一致。而且在all组、anll组中il15r三个亚基mrna的表达水平均比非白血病组低，说明急性白血病il15 受体三个亚基无论是表达率还是表达水平均要低于非白血病组。
在白血病中,除少数类型白血病细胞外,人们检测到大多数白血病细胞有fas 的高表达[12] , fas/fasl 系统作为诱导细胞凋亡的一条重要途径,也参与了白血病的发病过程。并且发现fas的表达与白血病的病情进展、治疗效果及预后密切相关。已有研究表明il15不仅能阻止自发的凋亡而且能够阻止fas引起的死亡信号介导的广泛凋亡[13]；而且bcl2 家族通过调节某些细胞中的fas 介导凋亡,尤其是bcl2 基因的上调,能对一些肿瘤提供fas 抗性[14] ,对白血病细胞的作用则是阻止分化细胞凋亡。因此，il15r在急性白血病的发生发展中是否起到一定的作用，从而在一定程度上导致al发生的问题值得进一步探讨。
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