【摘要】 目的 探讨人神经胶质瘤细胞u251逃逸同种异体nk细胞免疫杀伤的机制。方法 以k562细胞为对照，应用ldh释放法检测不同效靶比时nk细胞体外杀伤u251细胞的活性。用rtpcr检测k562和u251细胞mhcⅰ类链相关分子a和b (mica/b)、人巨细胞病毒糖蛋白ul16结合蛋白(ulbp1～3)基因，用流式细胞仪检测两细胞mica/b、ulbp1～3和hlaⅰ分子的表达情况。效靶比20∶1时用单抗分别阻断k562和u251细胞表面mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3和hlaⅰ类分子，观察nk细胞对其杀伤活性的变化。结果 同一效靶比时nk细胞杀伤u251细胞的活性明显低于杀伤k562细胞的活性，两者之间差异有统计学意义(p＜0.05)；k562和u251细胞均表达基因mica/b和ulbp1～3，但u251细胞仅低表达ulbp2分子。用单抗封闭mica/b和ulbp1～3分子后，nk细胞对k562细胞的杀伤活性明显降低，对u251细胞的杀伤活性无明显改变。封闭hlaⅰ类分子后nk细胞对u251细胞的杀伤活性明显上升，对k562细胞的杀伤活性无明显改变。结论 u251细胞逃逸nk细胞免疫杀伤机制可能是由于u251细胞高表达hlaⅰ类分子，不表达nkg2d的配体mica/b和ulbp1～3。
【关键词】 神经胶质瘤 然杀伤细胞 自然杀伤细胞受体 细胞毒性试验 hlaⅰ分子
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率占全部脑部肿瘤的50%以上。wwW.11665.cOm因其生长活跃，沿神经纤维呈浸润性生长，与脑组织无明显的界限，外科手术难以完全切除。加上脑组织对射线的耐受性差及血－脑脊液屏障对药物渗透的限制作用，恶性神经胶质瘤对化疗和放疗仅为中度敏感，大部分肿瘤会在原肿瘤周边0.5～3.0cm范围内复发[1]。所以需要其他辅助治疗方法来控制肿瘤的复发，以延长生存期，改善远期疗效。nk细胞是肿瘤免疫治疗的新的研究热点。随着临床和基础研究进展，人们发现部分神经胶质瘤细胞有逃避nk细胞免疫杀伤的生物学行为[2]。本研究以k562细胞为对照，探讨人神经胶质瘤细胞u251逃逸nk细胞杀伤的机制，为提高nk细胞免疫治疗效果，寻找新的免疫治疗方案提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和细胞株 nk细胞分离缓冲液和抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司)，amo1(antimica, igg1)、bmo1 (antimicb, igg1)、m295(antiulbp1, igg1)、m310(antiulbp2, igg1)、m551(antiulbp3, igg1)(德国alexander. steinle教授惠赠)，fitc标记的鼠抗人hlaⅰ类分子单抗（w6/32, igg2a）和山羊抗小鼠igg (ebioscience公司)，rpmi1640(gibco公司)，ldh杀伤活性检测试剂盒(promega公司)，trizol (invitrogen公司)，takara rna kit(amv)ver.3.0（takara公司），胎牛血清(杭州四季青公司)。人神经胶质瘤细胞株u251由中南大学湘雅医学院遗传研究所惠赠，人红白血病细胞株k562由本室冻存。用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基，在37℃、5%co2、充分湿度的孵箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。
1.2 nk细胞的分离纯化 用梯度密度沉淀法常规分离5例健康个体外周血单个核细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，按每107细胞加入80μl nk细胞分离缓冲液和20μl抗cd56免疫磁珠，4℃孵育15min，加入1ml的缓冲液，离心，弃上清。然后按108细胞/500μl缓冲液悬浮细胞，加入minimacs磁场中的分选柱，进行分离。用500μl缓冲液冲洗分选的阳性细胞，共3次。取下分选柱，置于无菌试管上，加入rpmi1640培养基1ml，用推注器推出分选的阳性细胞，获得cd3-cd56+细胞即为nk细胞。
1.3 nk细胞的细胞毒实验 用5%胎牛血清rpmi1640悬浮u251和k562细胞，作为靶细胞，加于96孔板中，每孔1×104细胞/50μl。以nk细胞为效应细胞，按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)分别加入相应数量的效应细胞50μl。另设培养基对照孔，效、靶细胞自然释放孔，靶细胞最大释放孔，各组均设3个复孔。于孵箱中培养4h，靶细胞最大释放孔提前45min加10μl裂解液，离心，每孔吸取上清50μl转入另一96孔板中，加入50μl ldh底物反应液，室温避光放置30min，每孔加50μl反应终止液，酶标仪490nm处测od值。抗体封闭试验以效靶比20∶1时，amo1、bmo1、m295、m310和m551分别与k562和u251细胞室温孵育15min，再加入nk细胞检测杀伤率。nk细胞杀伤率(%)=(实验组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值-效应细胞自然释放组od平均值)/(靶细胞最大释放组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值)×100%。
1.4 mhcⅰ类链相关分子a和b(mica/b)和人巨细胞病毒糖蛋白ul16结合蛋白(ulbp1～3) mrna的检测 引物参考文献[3]设计，由上海生工公司合成。收集k562和u251细胞，用trizol一步法直接提取总rna，紫外分光光度计测rna含量。取2μg总rna，加入20μl逆转录体系(25mm mgcl2 2μl、10mm dntp mixture 2μl、10×rt buffer 1μl、20μmol/l特异性下游引物0.5μl、rnase free ddh2o 3.75μl、rnase inhibitor 10u、amv reverse transcriptase 2.5u)混匀，50℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min终止反应。直接在逆转录反应产物中加入40μl pcr反应体系(5×pcr buffer 10μl、takara ex taq 1.25u、20μmol/l上游特异性引物0.5μl、ddh2o 29.75μl)混匀。95℃预变性5min，95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min终止反应。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析仪观察结果。
1.5 mica/b和ulbp1～3和hlaⅰ分子测定 收集肿瘤细胞，pbs洗涤2次，计数细胞，分管，用直接标记法检测hlaⅰ类分子，按1μg/106细胞浓度加入w6/32，4℃孵育30min，pbs洗涤3次。用间接标记法检测mica/b和ulbp1～3分子的表达，加入amo1、bmo1、m295、m310和m551一抗，4℃作用30min，pbs洗涤后再加fitc标记的山羊抗鼠igg1二抗，4℃孵育30min，pbs洗涤后上机，以同型igg1抗体( pharmingen公司)为阴性对照。用流式细胞仪分析1×104细胞中阳性细胞数，计算百分率。为减少误差，重复实验3次。
1.6 统计学方法 所有实验数据以均数±标准差(±s)表示， 应用spss13.0软件处理数据，采用独立样本t检验以及单向方差分析。
2 结果
2.1 nk细胞的纯度 流式细胞仪检测nk细胞(cd3-cd16+cd56+)的纯度为（89.4±3.26）%。
2.2 nk细胞杀伤活性
2.2.1 不同效靶比时nk细胞杀伤k562和u251细胞的活性见表1。同一效靶比时nk细胞对两种细胞的杀伤率之间的差异有统计学意义(p＜0.05)。不同效靶比之间nk细胞对k562细胞杀伤率的差异有统计学意义(p＜0.05)，对u251细胞杀伤率的差异无统计学意义(p＞0.05)。表1 不同效靶比时nk细胞杀伤k562
和u251细胞的情况（％，±s）
5∶110∶120∶140∶1k562细胞29.32±1.1745.33±1.7858.37±2.3572.37±3.06 u251细胞4.69±0.323.47±0.845.36±1.135.81±0.82
2.2.2 效靶比20∶1时用抗体分别封闭靶细胞表面相应分子后nk细胞的杀伤情况见表2。阻断靶细胞nkg2d的各配体，nk细胞对k562细胞杀伤率有明显下降，对u251细胞的杀伤率无明显变化；阻断hlaⅰ分子，nk细胞对k562细胞杀伤率无明显变化，对u251细胞的杀伤率明显上升。
2.3 k562、u251细胞mica/b和ulbp1～3基因的表达情况 两种细胞在mrna水平均表达5种基因，见图1。
2.4 k562和u251细胞表面mica、ulbp1～3和hlaⅰ分子的表达情况，见表3、图2。
3 讨论
nk细胞是天然免疫的主要承担者，是机体抗肿瘤免疫的第一道天然防线。nk细胞功能的发挥由其细胞表面活化性和抑制性受体传递的信号共同决定[4]。nk细胞表面主要抑制性受体为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，其共同特征是胞质区末端含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)，其配体为mhcⅰ分子。当抑制性kir与mhc分子结合后，引起kir分子在胞膜中聚集，使itim的酪氨酸磷酸化，向nk细胞传递抑制性信号，使其不杀伤靶细胞[5]。nk细胞表面活化性受体大致分为两大类，一类是mhcⅰ类分子特异性受体；另一类是非mhcⅰ类分子特异性受体，包括c型凝集素受体
1：dna marker；2：mica（635bp）；3：micb（690bp）；4：ulbp1（319bp）；5：ulbp2（327bp）； 6: ulbp3（321bp）；7：βactin (510bp)
图1 u251、k562细胞mica/b和
ulbp1～3 mrna的表达情况
和自然细胞毒受体(ncr)。nkg2d是c型凝集素受体超家族中的成员[6]，是nk细胞表面重要的活化受体，其配体为mica/b和ulbp1～3。nkg2d与肿瘤细胞表面的配体分子相互交联后，可以直接活化nk细胞，触发nk细胞的细胞毒活性，在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用。
本研究结果显示，同一效靶比时nk细胞杀伤u251细胞的活性明显低于杀伤k562细胞的活性，两者之间差异有统计学意义(p＜0.05)。表明以nk细胞杀伤敏感的细胞k562为对照，u251细胞抵抗nk细胞的杀伤。用rtpcr方法检测发现，k562和u251细胞在mrna水平均表达mica/b和ulbps基因，但流式细胞仪并未在u251细胞表面检测到mica/b和ulbps分子。另外，流式细胞仪检测发现u251细胞高表达hlaⅰ类分子，而k562细胞却不表达。因此可以推测，u251细胞通过hlakir信号途径向nk细胞传递抑制性信号，抑制性信号的参与会提高nk细胞的活化阈值。而u251细胞又不表达所有5个nkg2d的配体，不能向nk细胞传递活化性信号。因此与活化性信号相比，抑制性信号明显占优势，所以u251细胞抵抗同种异体nk细胞的杀伤。而k562细胞的情况则恰恰相反，其表面缺乏hlaⅰ分子，不会通过hlakir系统向nk细胞传递抑制性信号，没有抑制性信号对活化性信号的对冲，nk细胞活化的阈值就低。同时k562细胞又高表达活化性受体 表2 效靶比20∶1时阻断靶细胞表面相应分子后nk细胞的杀伤情况表3 u251和k562细胞表面mica/b和ulbp1～3的表达情况 图2 k562细胞和u251细胞表面nkg2d的配体和hlai类分子的表达情况
nkg2d的5种配体，因此任何同种异体nk细胞都表现出对k562细胞有很强的杀伤力。在效靶比为20∶1时我们用w6/32抗体阻断肿瘤细胞表面的hlaⅰ分子后，nk细胞对u251细胞的杀伤能力明显上升，而对k562细胞的杀伤活性没有明显变化。用amo1、bmo1、m295、m310和m551抗体分别封闭靶细胞表面的相应配体，结果显示，nk细胞对k562细胞的杀伤能力明显降低，而对u251细胞的杀伤活性没有明显变化。说明nkg2d配受体和hlakir信号系统确实参与调节nk细胞对u251细胞的杀伤作用，也证实了我们上述的推理。但抗体阻断试验并没有完全阻断nk细胞杀伤k562细胞的活性，说明除了nkg2d介导的杀伤活性外，尚有其他信号通路参与nk细胞对其的杀伤作用。
本实验结果和friese等[3]的研究一致。friese等发现人神经胶质瘤细胞ln229虽然表达mica，但由于该类肿瘤细胞高表达hlaⅰ类分子，因而对nk细胞抵抗。将转染mica基因的ln229细胞(ln229/mica)和未处理的ln229细胞接种于裸鼠皮下，发现ln229/mica肿瘤生长明显延迟，体积明显缩小。该研究表明增强nk细胞活化性信号，可以对抗抑制性信号，提高nk细胞的细胞毒活性。另外本研究发现u251细胞在mrna水平表达mica/b和ulbp基因，但细胞表面mica/b和ulbp蛋白的表达率极低。因此，研究如何使这些基因转录成蛋白表达在胶质瘤细胞表面，或者降低胶质瘤细胞的hlaⅰ分子，增强nk细胞的杀伤活性，将会为寻找新的免疫治疗方案提供新的思路。
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