声动力化学疗法对大鼠脑胶质瘤凋亡及相关基因表达的影响
【关键词】 神经胶质瘤;声动力疗法;血卟啉类;细胞凋亡
【摘要】 目的 摘要 目的 探讨声动力化学疗法(sdt)对大鼠脑胶质瘤凋亡及相关基因表达的影响。方法 以大鼠颅内c6胶质瘤为实验模型，观察sdt组、单纯照射组、血卟啉单甲醚(hmme)组、对照组脑胶质瘤组织学变化、原位凋亡检测、cytc和caspase3蛋白表达水平。结果 sdt组随着时间的延长，肿瘤组织坏死逐渐增加，24 h达到高峰;单纯照射组可见肿瘤组织坏死较sdt组明显少;对照组及hmme组标本各时间段胶质瘤细胞均未见坏死组织。原位凋亡检查见hmme组和对照组凋亡细胞极少，各时间点凋亡率无明显差别。处理后24 h，单纯照射组凋亡率明显高于hmme组和对照组(p<0.01);处理后3、7 d，凋亡率与hmme组和对照组无明显差别。sdt组处理后24 h，凋亡率明显高于其他3组(p<0.01)。处理后3、7 d，凋亡率与其他3组无明显差别。hmme组和对照组各时间点cytc和caspase3蛋白表达率无明显差别。单纯照射组cytc和caspase3蛋白表达率高于hmme组和对照组(p<0.01);处理3、7 d后cytc和caspase3蛋白表达率与hmme组和对照组无明显差别。sdt组处理后24 h，cytc和caspase3蛋白表达率明显高于其他3组(p<0.01)。WwW.11665.com处理后3、7 d，cytc和caspase3蛋白表达表达率与其他3组无明显差别。结论 sdt对大鼠脑胶质瘤有明显的抑制效应，早期可能通过损伤线粒体后，释放cytoc，激活caspase3而直接启动胶质瘤细胞本身凋亡程序。
【关键词】 神经胶质瘤;声动力疗法;血卟啉类;细胞凋亡
【abstract】 objective to study the apoptosis and related gene expression of sdt on c6 glioma cells in vitro.methods the rat brain c6 glioma was as experimental model to observe process changes of brain glioma in situ apoptosis detection，cytc protein，caspase3 protein expression level of four (sdt，irradiation，hmme，control) groups.results with time，sdt group had the increased tumor necrosis，24 h reached the peak;irradiation group had visible tumor necrosis，but significantly less than that of sdt group;control group and each time group had hmme glioma cells without necrotic tissue.apoptosis in situ inspection showed control group and hmme group had few apoptotic cells at different time points without significant difference.treated for 24 h，apoptotic rate of irradiation group was significantly higher than that of hmme and control groups(p<0.01);treated for 3，7 d，had no significant difference.treated for 24 h，apoptosis of sdt group was significantly higher than that of the other groups(p<0.01);treated for 3，7 d，had no significant difference.cytc and caspase3 protein expression results showed，hmme and control groups at different time points had no significant difference;irradiation group treated 24 h，proteins expression were higher than those of hmme and control groups(p<0.01);treated for 3，7 d，expression rates had no significant difference.sdt group treated for 24 h，proteins expression was significantly higher than that of the other groups(p<0.01).treated for 3，7 d，protein expression had no significant difference among the other three groups.conclusions sdt has significant inhibitory effect on rat glioma，possibly through damaging mitochondria early after the release of cytoc，activation of caspase3，starting directly apoptosis process of glioma cells.
【key words】 glioma;sonodynamic therapy;hematoporphyrins;apoptosis
声动力化学疗法(sonodynamic therapy,sdt)是一种肿瘤治疗的新方法，对体外大鼠c6胶质瘤细胞有明显杀伤作用〔1〕,为观察sdt对大鼠脑胶质瘤的生物学效应，本文以大鼠颅内c6胶质瘤为模型，观察sdt处理后大鼠脑胶质瘤的形态学、凋亡检测及相关基因表达的变化，以完善sdt抗胶质瘤理论。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大鼠c6胶质瘤细胞(哈尔滨医科大学神经外科研究所)、wistar大鼠(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心)、血卟啉单甲醚(hmme，北京英发康美技术开发有限公司)、胎牛血清(天津tbd公司) 、rpmi1640培养液 (美国hylone公司)、胰蛋白酶(美国amresco公司) 、tunel凋亡检测试剂盒(宝灵曼公司)、兔抗鼠cytc、caspase3免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔igg免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物制品有限公司)、sabc试剂盒通用型(zymed公司)、dab显色剂(北京中杉金桥生物制品有限公司)。
1.2 仪器
单纯照射天使多功能治疗仪(天使科技控股有限公司)、大鼠脑立体定向仪(上海江湾ⅱ型)、mir机(日本东芝公司1.5tvisrt型)、倒置相差显微镜(日本olymp单纯照射公司ix70型)、co2培养箱(上海herae单纯照射公司bb5060型)、洁净操作台(上海力申科学仪器有限公司hfsate1200型)、离心机(上海安亭科学仪器厂802b型)。
1.3 c6胶质瘤细胞培养
c6胶质瘤细胞接种于含10%胎牛血清的rpmi1640完全培养液25 ml培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5% co2和95%空气的培养箱中常规培养，待细胞处于对数生长期时实验。
1.4 大鼠c6脑胶质瘤模型的制作
wistar大鼠(雄性，体重250～350 g)96只。术前12 h禁食、禁水，1%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于江湾ⅱ型立体定向仪上,常规方法制作大鼠颅内c6脑胶质瘤模型〔2〕。术后连续3 d注射青霉素4万u/d，常规饲养。
1.5 实验分组
大鼠接种c6胶质瘤术后14 d，经mir扫描，待肿瘤直径达3～5 mm随机分成4组：sdt组(1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，尾静脉注射hmme10 mg/kg，2 h后1.0 mhz频率、0.5 w/cm2光强度、120 s照射)、单纯照射组、单用hmme组(尾静脉注射hmme10 mg/kg)和未处理的对照组，每组24只。大鼠避光7 d，常规饲养。
1.6 原位凋亡检测和cytc蛋白、caspase3蛋白表达水平观察
4组大鼠处理后24 h、3，7 d分别随机处死8只，开颅取出肿瘤组织。标本常规固定、包埋、切片。①tunnel法检测细胞凋亡情况，方法按照roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，常规封片，显微镜下观察。结果判定是以核阳性为判定标准，并结合he染色40倍显微镜下观察，对he染色证实为坏死的细胞不计数。细胞核内的棕褐色染色为阳性细胞，400倍显微镜下每张切片随机选择5个视野，两人双盲计数500个细胞中的阳性细胞数，取均值。排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域，因为这给单个凋亡细胞的鉴别带来困难。计算凋亡细胞百分率：凋亡细胞百分率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。②标本免疫组织化学染色采用sabc法，按说明书进行操作，常规封片，显微镜下观察。cytc蛋白、caspase3蛋白表达结果判定：每张切片400倍显微镜观察，随机选择5个视野,两人双盲计数500个细胞中的阳性细胞数(细胞胞浆内棕褐色染色)，取均值。计算蛋白表达百分率，蛋白表达百分率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。对四组各时间点cytc蛋白、caspase3蛋白表达率分别与凋亡率计算pearson相关系数(r值)。
1.7 统计学处理
数据以x±s表示，采用sas9.1.3统计软件，对原位调亡、cytc蛋白、caspase3蛋白表达水平数据进行析因分析，并作两两比较;采用pearson相关进行相关分析。
2 结 果
2.1 一般状态
在实验过程中因操作不慎死亡或种瘤失败的大鼠予以重新补充。大鼠接种后均无感染，从接种后第3天开始，部分大鼠逐渐出现消瘦、肢活动不灵活、抽搐、易激惹等表现，濒死前4组均表现频发抽搐、极度消瘦、恶病质等症状。
2.2 组织学检查结果
处理前胶质瘤细胞均具有异形性特征，瘤组织内有新生血管形成，肿瘤组织与脑组织无明显分界。sdt组处理后24 h肿瘤组织不规则片状坏死，坏死区中心部分无细胞结构，碎裂、固缩的胶质瘤细胞大量分布于坏死区向正常肿瘤组织过渡的交界区;单纯照射组处理后24 h肿瘤组织出现小片状坏死区，期间散在点状坏死细胞，亦多分布于坏死区向正常肿瘤组织过渡的交界区(图1)。sdt组处理后3 d肿瘤组织不规则片状坏死区面积较24 h时明显减小，坏死区内仍可见较多碎裂、固缩胶质瘤细胞;单纯照射组处理后3 d肿瘤组织内偶见点状坏死细胞。sdt组与单纯照射组处理后7 d时胶质瘤组织形态同对照组及hmme组，未见坏死、碎裂的细胞。图1 sdt组和单纯照射组he染色处理后24 h组织学结果(×40)
2.3 原位凋亡检测结果
hmme组和对照组凋亡细胞极少，各时间点凋亡率比较，无统计学意义(表1)。切片均未见明显坏死细胞，偶见凋亡细胞。单纯照射组处理后24 h，切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞，凋亡细胞散在分布，凋亡率明显高于hmme组和对照组(p<0.01);处理后3 d切片可见散在坏死细胞，偶见凋亡细胞，凋亡率较处理后24 h下降，与hmme组和对照组比较，无统计学意义;处理后7 d，切片未见明显坏死细胞，偶见凋亡细胞，凋亡率与hmme组和对照组比较，无统计学意义。sdt组处理后24 h，切片可见明显片状坏死区或坏死细胞，凋亡细胞多分布于片状坏死区周边，或与坏死细胞夹杂，凋亡率明显高于其他3组(p<0.01)(图2);处理后3 d，切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少，凋亡细胞少见，但凋亡率与其他3组比较差异显著(p<0.01);处理后7 d，切片未见坏死细胞，凋亡细胞偶见，凋亡率与其他3组比较，无统计学意义。图2 单纯照射组和sdt组原位凋亡检测处理后24 h(×400)
2.4 cytc蛋白、caspase3蛋白表达结果
hmme组和对照组cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞偶见，cytc蛋白、caspase3蛋白表达率各时间点比较，无统计学意义。切片均未见明显坏死细胞。单纯照射组处理后24 h，切片可见小片状坏死区和散在分布的坏死细胞，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞多分布于小片状坏死区周边，或与坏死细胞夹杂，表达率高于hmme组和对照组(p<0.01);处理后3 d切片可见散在坏死细胞，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞偶见，多与坏死细胞夹杂或分布其周边，但表达率较处理后24 h明显下降，与hmme组和对照组比较，无统计学意义;处理后7 d，切片未见明显坏死细胞，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞偶见，蛋白表达率与hmme组和对照组近似，无统计学意义。sdt组处理后24 h，切片可见明显片状坏死区或坏死细胞，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞多分布于片状坏死区、坏死细胞周边或夹杂其中，蛋白表达率明显高于其他3组(p<0.01);处理后3 d，切片见片状坏死区明显缩小、坏死细胞数量明显减少，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞多分布于片状坏死区或坏死细胞周边，数量也明显减少，但cytc蛋白、caspase3蛋白表达率与其他3组比较差异显著(p<0.01);处理后7 d，切片未见明显坏死细胞，cytc蛋白、caspase3蛋白表达阳性细胞偶见，蛋白表达率与hmme组和对照组近似，无统计学意义(表1和图3)。表1 各组大鼠不同时间点凋亡率、cytc和caspase3蛋白表达率的比较图3 sdt组和单纯照射组处理后24 h cytc和caspase3蛋白表达(×400)
2.5 sdt组cytc和caspase3蛋白表达率与凋亡率的相关性分析
cytc蛋白和caspase3蛋白表达率与凋亡率呈正相关(均为r=0.99，p<0.01)。
3 讨 论
研究表明，化疗、放疗、基因治疗、光动力疗法(pdt)等均可促进胶质瘤细胞的凋亡过程，提高疗效，延长患者的生存期。研究已经证实sdt可引起体外c6胶质瘤细胞凋亡〔1〕，因此凋亡也是sdt杀伤c6胶质瘤细胞的方式之一。通过组织学及原位凋亡检查，发现大鼠颅内胶质瘤sdt处理后早期(24 h)肿瘤组织坏死及凋亡均达到高峰，随后坏死及凋亡的瘤组织均逐渐减少，至处理后7 d时肿瘤组织中已见不到坏死及凋亡的瘤细胞，这表明：①胶质瘤组织坏死和凋亡时间变化规律基本吻合，也表明凋亡是sdt杀伤胶质瘤的重要方式;②sdt处理大鼠颅内胶质瘤，24 h达到作用高峰，提示sdt如应用于临床，使用的时间间隔为24 h左右;③凋亡高峰出现于处理后早期(24 h)，但凋亡时间较体外(6 h)略后移，这可能因为单纯照射作用于体外细胞时衰减低，而作用于颅脑组织中衰减增强，较低的声强度启动细胞凋亡时间较长有关;④24 h后细胞凋亡明显减少，处理后7 d，4组凋亡率已无统计学意义，表明sdt仅处理后24 h内对细胞凋亡存在明显影响，而中远期则无影响。
单纯照射处理后也可引起胶质瘤坏死及凋亡，其高峰同样发生在早期(24 h)，但肿瘤坏死面积及凋亡率明显较sdt低，提示：①单用单纯照射有较弱的抗胶质瘤效应;②凋亡也是单纯照射杀伤体内胶质瘤的方式之一。单用hmme未显示出抗胶质瘤效应，对细胞凋亡无影响。通过与单纯照射组、hmme组及对照组比较，表明sdt的杀伤胶质瘤效应并非简单的单纯照射+hmme效应，而是二者结合发生一系列声化学反应，激活声敏剂分子，通过增效声动力效应杀伤肿瘤细胞。刘全宏等〔3〕提出sdt诱导肿瘤细胞凋亡的途径有可能依赖于线粒体结构损伤后释放cytoc等蛋白，激活caspase家族蛋白，从而导致细胞凋亡。其中caspase3作为关键蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必由之路〔4〕。本结果表明sdt处理后早期出现细胞凋亡可能是损伤线粒体后，释放cytoc，激活caspase家族蛋白，经过一系列细胞凋亡蛋白酶级联反应，活化了关键蛋白酶caspase3引起的。单纯照射处理后早期(24 h)也出现cytoc、caspase3蛋白较强的表达，说明单纯照射诱导细胞凋亡可能也与线粒体结构损伤后释放cytoc等蛋白，激活caspase3有关。单用hmme未出现cytoc、caspase3蛋白的表达，同样未启动凋亡。
综上，sdt对大鼠脑胶质瘤有明显的抑制效应，早期可能通过损伤线粒体后，释放cytoc，激活caspase3，直接启动胶质瘤细胞本身凋亡程序，诱导大鼠脑胶质瘤细胞凋亡。
【参考文献】
1 宋大勇，岳 武，赵 钊，等.声动力化学疗法对体外c6胶质瘤细胞作用的研究〔j〕.中华神经外科杂志,2007;23(2):10710.
2 刘 斌，金必连，李 龄.激光间质内热疗联合顺铂治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究〔j〕.中国激光医学杂志,2001;10(2)：747.
3 刘全宏,王 攀,李 萌,等.声化学激活血卟啉诱导艾氏腹水肿瘤细胞凋亡〔j〕.动物学报，2003;49(7):6208.
4 李小明,孙志贤.细胞凋亡中的关键蛋白酶caspase3〔j〕.国外医学·分子生物学分册,1999;21(1):69.
