结直肠癌中survivin, pten表达及其与细胞增殖、凋亡的关联性
  【关键词】  survivin;,,pten;,结直肠肿瘤；细胞凋亡；增殖

    【abstract】  aim: to investigate the expressions of survivin and  pten, and their relationship with cell  proliferation and  apoptosis in colorectal cancer, and  to identify the role of survivin and ptn in colorectal tumorigenesis. methods:  flow cytometry was used to detecte the expressions of survivin and pten in 20 normal colonic mucosa, 20 adenomas and 54 colorectal cancers. apoptotic   peak was examined in colorectal cancer. ki67 was determined with  immunohistochemical sp staining. results:  the expression of survivin in cancer(56.7±5.2) was higher than that in adenoma (18.4±3.4, p＜0.05). in contrast, normal colonic mucosa did not express survivin. the expression of pten showed a decrement  from normal colonic mucosa(87.6±3.1), adenoma(66.4±3.2) to colorectal cancer (36.3±3.4, p<0.05 respectively). in well and moderately differentiated cancers, survivin expression was significantly lower than that in  poor differentiated cancers, while pten expression was significantly higher than that in  poor differentiated cancer (p＜0.05 respectively). however, the expressions had  no correlation with patients age, gender, dukes stage and lymph node metastasis (p>0.05 respectively). survivin positive cancers had significantly lower values in  apoptosis index than negative tumor did, while pten positive cancers had significantly higher values in  apoptosis index than negative tumor did (p＜0.05 respectively). ki67 labeling index(li) in survivin positive cancer was higher than that in negative tumor, while ki67 li in pten positive cancer was lower than that in negative tumor (p<0.05 respectively). a significant inverse correlation was observed between the expressions of survivin and pten（rs=-0.846, p＜0.05）. conclusion: survivin and  pten may play  important roles in human colorectal tumorigenesis through the inhibition of apoptosis and acceleration of proliferation activity.

    【keywords】 survivin; pten;  colorectal neoplasms; apoptosis; proliferation

    【摘要】  目的：  探讨survivin, pten与结直肠癌细胞增殖和凋亡的关系及其在结直肠癌发生、发展中的作用. 方法： 应用流式细胞术测定正常肠黏膜、腺瘤、结直肠癌中survivin, pten表达及结直肠癌细胞凋亡； 用免疫组织化学法测定结直肠癌细胞ki67表达. 结果： survivin在正常肠黏膜中无表达，在腺瘤中表达率为18.4±3.4，结直肠癌中表达率为56.7±5.2，两者相比差异有显著性(p<0.05). pten阳性率由正常肠黏膜（87.6±3.1）、结直肠腺瘤（66.4±3.2）、结直肠癌组织（36.3±3.4）呈逐渐降低趋势(p<0.05). 结直肠癌中survivin, pten的表达均与肿瘤分化程度相关(p<0.05)，而与dukes分期和淋巴结转移不相关（p>0.05）. 结直肠癌的凋亡指数，survivin高表达者明显低于低表达者(p<0.05)；pten高表达者明显高于低表达者(p＜0.05). ki67标记的增殖指数，survivin高表达者明显高于低表达者(p＜0.05)；pten高表达者明显低于低表达者(p＜0.05). 结直肠癌组织中survivin与pten的表达呈负相关（rs=-0.846,  p<0.05）. 结论： 结直肠癌中survivin, pten通过调控细胞增殖和凋亡在结直肠癌的发生、发展中扮演着重要角色.

    【关键词】 survivin;  pten; 结直肠肿瘤；细胞凋亡；增殖

      癌基因与抑癌基因失活及异常表达，细胞增殖与凋亡失衡在肿瘤发生、发展中有着极其重要的作用. survivin是凋亡抑制蛋白家庭新成员，可作用于各种凋亡通路末端效应分子，抑制凋亡，可能是一种癌基因. pten是近年发现的一种抑癌基因，可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡. 我们用流式细胞仪检测正常肠黏膜、腺瘤、结直肠癌中survivin和pten的表达及结直肠癌细胞的凋亡，用免疫组织化学方法检测结直肠癌细胞ki67的表达，探讨survivin和pten在结直肠癌发生、发展中的作用及其与结直肠癌细胞增殖、凋亡的关联性.

    1材料和方法

    1.1材料手术切除、病理证实的结直肠癌标本54例，结直肠腺瘤20例及正常结直肠黏膜20例. 术前均未行放化疗或免疫治疗. 结直肠癌患者男29例，女25例；年龄24~76（52.4±8.0）岁；dukes a期5例，b期22例，c期18例，d期9例，有淋巴结转移26例，无转移28例. 高分化者13例，中分化者19例，低分化者22例. survivin兔抗人mab购自neomarker公司，pten鼠抗人mab购自santa cruz公司.

    1.2方法

    1.2.1survivin和pten表达检测取组织块1.0 cm×1.0 cm, pbs洗净血迹，机械破碎法制成单细胞悬液，细胞悬液经40 μm的尼龙网过滤，pbs洗，调节细胞每管为106细胞，pbs液洗涤1次，离心，弃上清，试管内加入兔抗人survivin或pten荧光mab 10 μl，对照管加入pbs，混匀，4℃孵育30 min, pbs洗涤1次，加入荧光二抗fitc, 4℃孵育30 min,  pbs洗涤1次，离心，清除多余未结合抗体后上机检测. 流式细胞仪为facs calibur(bector dickinson)，200 mw argonasor(488 nm)，用fsc和ssc点阵图gating完整细胞，用ssc，fl1双参数点阵图采集10 000细胞. survivin或pten阳性率=［(试管中survivin或pten阳性细胞数-阴性对照阳性细胞数)/10 000］×100%，设阳性率>30%为高表达.

 

    1.2.2结直肠癌细胞凋亡和ki67表达的检测细胞悬液0.5 ml加入试管，1500 r/min离心3~5 min，生理盐水冲洗3次，500~800 r/min离心3 min，去除细胞碎片. 聚甲醛固定，1500 r/min离心10 min，弃上清，悬起细胞，加入1 ml/l tritonx100液反应3 min，离心，弃上清，加入rna酶1~2 ml，37℃水浴中振荡30 min，加入pi液dna染色至少30 min，流式细胞仪检测结直肠癌细胞凋亡率. 另组织切片作ki67检测，操作按说明书进行，细胞质染成棕黄色为阳性，用图像分析系统（hiphs2000）计算阳性细胞百分比.

    统计学处理： 数据用x±s表示，采用spss 10.0统计分析软件，3组间样本比较用方差分析，各组间两两比较采用snkq检验，相关性分析采用spearman等级相关分析，p<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1survivin的表达survivin在正常肠黏膜中无表达；结直肠腺瘤、结直肠癌组织中分别为18.4±3.4和56.7±5.2，两者比较差异有统计学意义(p＜0.05). 结直肠癌组织中survivin表达与癌组织分化程度有关，低分化者survivin表达率明显高于中、高分化者(58.2±3.8 vs 56.2±3.2, 54.9±3.6, p＜0.05)，而与结直肠癌患者年龄、性别，淋巴结转移和dukes分期无关（p＞0.05）.

    2.2pten的表达pten阳性率在正常肠黏膜、结直肠腺瘤、结直肠癌组织中分别为87.6±3.1，66.4±3.2和36.3±3.4，呈逐渐降低趋势(p＜0.05). 结直肠癌组织中pten表达与癌组织分化程度有关，低分化者pten表达率明显低于中、高分化者(34.7±3.5 vs 36.7±3.7, 38.4±3.4, p<0.05)，而与结直肠癌患者年龄、性别，淋巴结转移和dukes分期无关（p＞0.05）.

    2.3survivin和pten表达与细胞增殖、凋亡的关系结直肠癌组织中随着肿瘤分化程度的降低，survivin阳性率逐渐增加，而pten的阳性率却逐渐降低，通过等级相关性分析发现结直肠癌组织中survivin与pten的表达呈负相关（rs=-0.846,  p＜0.05）.

结直肠癌的凋亡指数，survivin高表达者明显低于低表达者；pten高表达者明显高于低表达者，而ki67标记的增殖指数，survivin高表达者明显高于低表达者；pten高表达者明显低于低表达者（表1）.表1结直肠癌中survivin, pten表达与凋亡、增殖的关系

    3讨论

    在由正常肠黏膜腺瘤腺癌的发展过程中，细胞增殖、凋亡紊乱是其重要机制. 从我们检测的survivin, pten在正常肠黏膜、腺瘤组织、结直肠癌组织中的表达趋势看survivin, pten参与了结直肠癌的发生，促进了腺瘤的形成及其向癌的发展. 而survivin, pten高、低表达者间凋亡指数、增殖指数的差异则说明pten作为抑癌基因在维持正常细胞的稳定性中发挥着重要作用，当pten基因缺失、突变或失活，pten蛋白表达下调及活性改变，其抑制细胞增殖、分化的能力减低. 而作为癌基因的survivin表达增强时，抑制细胞凋亡的能力增加，细胞凋亡降低，增殖与凋亡失衡，促进肿瘤的发生、发展.

    癌基因survivin与抑癌基因pten生物学效应相反，其作用环节却一致，二者可能存在着协同作用. pallares等［1］研究发现在子宫内膜癌的发生过程中pten可能通过上调survivin的表达导致细胞增殖与凋亡的紊乱. 我们发现结直肠癌组织中随着肿瘤分化程度的降低，survivin阳性率逐渐增加，而pten的阳性率却逐渐降低，结直肠癌组织中survivin与pten的表达负相关，说明二者在肿瘤的发生发展中可能发挥着协同作用，随着肿瘤恶性程度的增加，癌组织中survivin表达增加，pten蛋白表达下调. 这一结论与杨冬等［2］的结果一致.

    结直肠癌中survivin, pten与肿瘤分化程度相关，在一定程度上反映了结直肠癌的恶性程度，或许可作为预后不良的参考指标，但我们发现其与dukes分期和淋巴结转移不相关. 从理论上推测，survivin, pten高表达的肿瘤可具有更为恶性的生物学行为，但由于survivin, pten在结直肠癌中的表达和生物学效应与多种因素有关，且在结直肠癌进展过程中还受其他多种如bcl2, p53, apc等基因的调控，是多基因、多因素共同作用的结果，故仅survivin, pten指标，并不能反映结直肠癌浸润及转移的情况. 尽管redel等［3］报道，直肠癌survivin高表达者的5 a生存率明显低于高表达者，其转移率前者是后者的的4倍. zhang等［4］总结多方研究认为survivin是一种癌基因，是可能具有潜在价值的肿瘤标志物，survivin可作为一个较普遍的标志物用于结直肠癌的早期诊断，我们认为尚需进一步研究.

    【参考文献】

    ［1］ pallares j, martinez jl, dolecet x, et al. survivin expression in endometrial carcinoma: a tissue microarray study with correlation with pten and stat3 ［j］. int j gynecol pathol, 2005,24(3):247-253.

    ［2］  杨冬，朱尤庆，齐健. survivin基因与pten蛋白在结直肠腺癌组织中的表达及临床意义［j］. 癌症，2004,23(3):306-309.

    ［3］  rodel f, hoffmann j, grabenbaner gg, et al. high survivin expresion is assotiated with reduced apoptosis in rectal cancer and may predict diseafree survival after preoperative radiochemotherapy and surgical rescction. stranlenther onkol ［j］. 2002,178(8):426-435.

    ［4］  zhang jy, casiano ca, peng, et al. enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumorassociatecl antigens ［j］. cancer epidemiol biomarkers prev, 2003,12(2):136-143.