【摘要】  目的 探讨三磷酸腺苷结合盒转运子a1(atp binding cassette transporter 1,abca1)基因r219k多态性与冠心病(coronary heart disease, chd)易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(pcr_rflp)方法检测了162例冠心病患者和186名对照的abca1基因r219k基因型和等位基因的分布。结果 两组基因型频率均符合hardy_weinberg平衡。对照组的rk和kk基因型的频率显著高于chd组（73.66%比56.17%,p＜0.05），同样,对照组k等位基因的频率显著高于chd组（48.66%比36.11%，p＜0.01）。调整年龄、性别、体重指数、吸烟和高血压等因素后，携带至少1个219k等位基因的个体显著减少患冠心病的危险(or=0.38;95% ci=0.22-0.65)。结论 abca1基因r219k多态性与中国温州汉族人群冠心病的遗传易感性相关，其中k等位基因可能是冠心病的保护因子。

【关键词】  冠心病;三磷酸腺苷结合盒转运子a1;多态性

the association between abca1 gene r219k polymorphism and coronary heart disease. zhang xiong_xin, xu li_xin, zhang huai_qin，et al. the first affiliated hospital of medical college, zhejiang university, zhejiang 310003, china

    ［abstract］ objective to explore the association between atp binding cassette transporter 1（abca1） gene r219k polymorphism and coronary heart disease(chd) in chinese han population. methods using polymerase chain reaction_restrictive fragment length polymorphism (pcr_rflp), 162 chd patients and 186 controls were analyzed for the polymorphism, genotype and allele distribution of abca1 gene r219k. results the distribution of abca1 genotype in both groups was in hardy_weinberg equilibrium. the frequency of rk and kk genotype in control group was significantly higher than that in chd group(73.66% vs 56.17%,p＜0.05); similarly, the frequency of k allele in control group was significantly higher that in chd group (48.66% vs 36.11%, p＜0.01).after adjusted for the influence of age, gender and other chd risk factors by multiple logistic regression analysis, those people who have at least one allele markedly decrease chd risk （or=0.38, 95%ci=0.22-0.65）. conclusions abca1 gene r219k polymorphism is associated with chd risk in chinese han population, k allele may serve as a genetic protective factor for coronary heart disease.

    ［key words］ coronary heart disease; atp binding cassette transporter 1; polymorphism

    流行病学研究显示低血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl_c)水平是冠心病独立的预测因子和重要的危险因素。Www.11665.coM血浆hdl_c水平受许多遗传和环境因素的影响，abca1活性是血浆hdl_c水平的一个重要决定因素［1］，abca1在胆固醇逆转运过程中起第一步限速作用［2］。近来，国外文献报道，abca1基因的某些单核苷酸多态性与chd易感性有着一定的关联性,其中r219k多态性在不同人群中表现为与降低的chd危险性相关［3,4］。本文探讨中国温州汉族人群冠心病患病风险和abca1基因r219k多态性的关系,并分析这个多态性对血脂的影响。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料：病例为（2004年1月至2006年7月）温州医学院附属第一医院心血管内科住院的患者。冠心病组162例，其中男121例,女41例，年龄48～81(平均68.3±10.4)岁。冠心病组中74例为急性心肌梗死患者，急性心肌梗死的诊断标准符合中华医学会心血管病学分会2001年修订的《急性心肌梗死诊断和治疗指南》中的诊断标准［5］，其余病人均经冠状动脉造影证实，即左主干、右冠、左前降支、左回旋支中有一支以上狭窄≥50%。对照组186例，其中男123例,女63例，年龄45～76(平均63.5±10.3）岁。对照组中，52例为经冠状动脉造影排除冠心病的同期住院患者，其余对象为同期在我院体检中心体检的健康对照（均无冠心病史，心电图检查无冠心病证据，并且排除恶性肿瘤，免疫炎症性疾病和肝肾功能不全者）。所有的研究对象均来自汉族人群，无亲缘关系。

    1.2  方法：

    1.2.1  血脂水平的检测：研究对象均采用空腹12h后抽取外周血5ml测定血脂水平。tg和tc(总胆固醇)采用氧化酶法测定,hdl_c、ldl_c(低密度脂蛋白胆固醇)用直接法测定。

    1.2.2  基因组dna提取：抽取研究对象的空腹静脉血2ml,以edta抗凝。采用人类基因组dna提取试剂盒(gentra公司)从300ul全血中提取基因组dna，然后放在-70℃下保存。

    1.2.3  pcr和基因定型：pcr引物根据genbank所收录的全序列(登录号:nm-005502)并参照文献［6］,由上海生物工程公司合成,上游引物：5'_gcaaggctaccagttacatttgacaag_3',下游引物：5'_gattggcttcaggatgtccatgttgg_3'。反应使用mastercyler 533型pcr扩增仪。pcr体系为20μl，含有基因组dna0.2～0.6μg，上下游引物各0.5umol/l，0.2mmol/l的4种dntp，2.0mmol/l的mgcl2，1u taq dan聚合酶，10×buffer 2μl，用去离子水补充至20μl。扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟、56℃退火30秒、72℃延伸45秒，共35循环；最后72℃延伸7分钟，扩增出大小为166bp的dna片段。扩增产物用xagi特异性限制内切酶在37℃水浴消化4小时后，2.5%琼脂糖凝胶电泳并在凝胶成像系统里判断酶切结果。

    1.3  统计学分析：用spss13.0软件包进行统计分析。计量资料的组间比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析，计数资料的组间比较采用卡方检验。基因型和等位基因与冠心病的相关性采用比数比(or,odds ratio)及其95%的可信区间(ci, confidence intervals)来表示，并用logistic回归来排除年龄，性别，以及冠心病的其他危险因素的影响。检验水准采用p=0.05。

    2  结果

    2.1  两组临床资料比较：两组间性别构成比以及血浆tc、ldl_c、hdl_c水平差异无显著性，其余的均具有统计学差异。在多因素统计分析中对这些因素进行了校正，见表1。表1  冠心病组和对照组临床特征比较

    2.2  基因型鉴定：含r219k多态性位点的pcr扩增产物长166bp，k等位基因存在限制性内切酶xagi切点,从而导致3种基因型的出现:rr型(无酶切位点的纯合子),酶切后长度仍为166bp;kk型(存在酶切位点的纯合子),酶切产物为101bp和65bp两个片段;rk型(3种片段的杂合子),酶切产物为166bp、101bp、65bp的3个片段(图1)。

    2.3  基因型和等位基因频率比较:表2和表3示abca1基因型和等位基因在冠心病组和对照组中的分布情况。两组基因型的分布均符合hardy_weinberg遗传平衡定律。在162例冠心病人中，基因型的分布为rr71例，rk65例，kk26例；而186例对照中，基因表2  冠心病组和对照组abca1基因r219k基因型频率的比较注：两组比较，*p＜0.01表3  冠心病组和对照组abca1基因r219k等位基因频率的比较注：两组比较，*p＜0.01

    型的分布为rr49例，rk93例，kk44例，两组分布具有显著性差异（x2=12.06,p＜0.01）。冠心病组r等位基因频率为63.89%，k等位基因频率为36.11%；对照组r等位基因频率为51.34%，k等位基因频率为48.66%，两组分布具有显著性差异(x2=11.13,p＜0.01)。调整年龄、性别、体重指数、吸烟和高血压等因素后，携带219kk基因型的个体较219rr携带者罹患冠心病的风险显著减少(or=0.34;95%ci=0.18-0.69),而携带至少1个219k等位基因的个体也显著减少患冠心病的危险(or=0.38;95% ci=0.22-0.65)。

    2.4  不同基因型患者间血脂水平的比较:将正常对照组分成k等位基因携带者和非携带者两个亚组,比较两个亚组间血清血脂成分水平的差异。k非携带者血清tg和ldl_c高于k携带者，k携带者hdl_c高于k非携者，两型比较均未见显著统计学意义（p＞0.05），见表4。表4  对照组不同基因型患者间血脂水平的比较

    3  讨论

    本研究在中国温州汉族人群中进行abca1基因r219k多态性与冠心病遗传易感性的关联研究。研究人群abca1基因r219k多态性的分布符合hardy_weinberg遗传平衡定律，表明该人群具有较好的代表性。本文结果显示，正常对照组r219k位点（rk+kk）基因型和k等位基因显著高于冠心病组,提示k等位基因携带状态是冠心病发病的一个保护因子,k等位基因携带者血清hdl_c水平高于rr基因型者，但未达显著统计学意义。

    低hdl_c水平是发生冠心病及严重程度的一个主要的独立的危险因子。hdl_c的抗动脉粥样硬化的功能与它促进胆固醇从外周细胞转运到肝脏(即胆固醇的逆向转运)有关［7］。1999年，人们阐明abca1基因缺陷是tangier病的病因。tangier病是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病,是由于abca1基因的突变使细胞内胆固醇流出障碍,导致网状内皮细胞及巨噬细胞内胆固醇沉积所致,主要表现为极度减少的血浆hdl_c水平,胆固醇的外流减少和明显增加的冠心病患病风险［8］。之后，人们发现abca1基因变异与血清hdl_c水平变化密切相关。abca1活性是血浆hdl_c水平的一个重要决定因素［1］,突变可导致胆固醇代谢异常。

    人类abca1基因位于9q31,约149kb,包括1453bp启动子及50个外显子,其所编码的abca1是由2261个氨基酸组成的膜蛋白。abca1促进细胞内的胆固醇和磷脂(主要是卵磷脂)转运至hdl前体apoa,因此该蛋白在逆转运过程中起第一步限速作用。abca1基因在白细胞、巨噬细胞和肝、肺、肾上腺及胎盘组织高度表达。此外，作为胆固醇转运子，abca1可以保护内皮的信号传导通路，已经发现abca1杂合子会损害一氧化氮活性，影响内皮功能［9］。

    至今为止，已发现90多个与疾病相关的abca1基因变异或snp位点,这些snp在人群中的发生率差异很大。r219k多态是abca1基因第219密码子g→a转换,导致arg→lys氨基酸替代，可能会影响蛋白质的功能。国外报告，这个多态性与冠心病的危险性相关，k等位基因是冠心病的保护因子［3,4］。对于是否同时伴有血浆hdl_c水平显著改变，研究结果并不一致。我们中国温州汉族人群中的研究结果显示对照组的rk和kk基因型的频率显著高于chd组（73.66%比56.17%,p＜0.05），同样,对照组k等位基因的频率显著高于chd组（48.66%比36.11%，p＜0.01）。调整年龄、性别、体重指数、吸烟和高血压等因素后，携带至少1个219k等位基因的个体显著减少患冠心病的危险(or=0.38;95% ci=0.22-0.65)。因此，可以认为abca1基因r219k多态性与中国温州汉族人群冠心病的遗传易感性相关，其中k等位基因是冠心病的保护因子。

    冠心病组的血脂水平可能受到调脂药物治疗和心肌梗死事件的影响,关于血清脂质水平和基因变异的相关性我们仅在对照组中进行。本文结果显示，对照组中k等位基因携带者血清hdl_c水平与非携带者相比，两者未见显著差异，与frikke_schmidt等［10］研究相似。因此，我们推测单个r219k核苷酸多态性对血清hdl_c水平影响甚微，r219k多态性可能跟其它多态位点有连锁作用，或者r219k的功能效应只在特定的遗传和环境背景下才具有显著意义，有待进一步研究。

    总之，本文结果提示abca1基因r219k多态性与中国温州汉族人群冠心病的遗传易感性相关，其中k等位基因可能是冠心病的保护因子，这种作用不伴有血浆hdl_c水平的显著改变。今后尚需大样本的进一步研究证实。

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