【摘要】 目的 观察鞣酸（tannic acid，ta）对链脲佐菌素（stz）诱发糖尿病（dm）大鼠血糖及肾脏功能和形态改变的影响。方法 用stz诱发大鼠dm模型后，随机分为dm模型组、氨基胍（ag）组和ta低高剂量组，另设正常对照组。ag组按40 mg·kg-1·d-1给予；ta低高剂量组分别按20及30 mg·kg-1·d-1给予；正常对照组和模型组每天给予等体积生理盐水，给药方式均为腹腔注射，共10 w。观察给药期间及10 w后大鼠的一般状况，检测各组大鼠血糖、血肌酐（cr）、血尿素氮（bun）、尿酸（ua）、24 h尿蛋白及观察肾脏形态学变化。结果 ta可改善dm大鼠基本状况，与模型组比较，ta组血糖、血清cr、bun和尿cr、尿蛋白均明显降低，光镜和电镜下观察显示，模型组大鼠较正常对照组大鼠肾小球明显增大，细胞数目增多，基底膜节段性增厚，部分足突融合。ta组上述异常均明显减轻。结论 ta可明显降低尿蛋白排泄，改善dm大鼠肾脏功能和形态学异常，对dm大鼠具有肾脏保护作用。
【关键词】 鞣酸；糖尿病；血糖；肾功能
糖尿病肾病（dn）是糖尿病（dm）常见而又严重的并发症之一，也是导致终末期肾脏疾病的常见病因〔1〕。dn发病机制十分复杂，目前药物对dn的治疗疗效仍不尽满意。我国药典上收载的五倍子鞣质，称为鞣酸或单宁酸（tannic acid,ta），广泛存在于植物界，约70%以上的中草药及某些食物中均含有此类化合物。wwW.11665.CoM目前已知，ta在医药学领域具有止血愈伤、抑菌抗病毒、抗氧化、延缓衰老等功效〔2〕，但ta对dn发生发展的影响尚不明确。本文观察ta对dm大鼠血糖、肾脏功能和结构改变的改善作用，为应用ta防治dn提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立
雄性wistar大鼠70只，体重180～220 g，购自吉林大学实验动物中心。适应性饲养1 w后，随机选取8只作为正常对照组，予标准饲料喂养。其余62只禁食12 h，链脲佐菌素（stz，购自sigma公司）按52 mg/kg体重（使用前用0.1 mol/l、ph4.2无菌柠檬酸盐缓冲液配成2%溶液）单次腹腔注射，正常对照组大鼠仅腹腔注射等体积0.1 mol/l柠檬酸盐缓冲液。注射stz后48 h，用尿糖试纸测尿糖，应在及以上，1 w后dm大鼠表现多饮、多食、多尿和体重明显减轻，再次测定尿糖，尿糖≥、血糖值≥16.67 mmol/l者确定为dm模型大鼠，给予标准饲料、充足的饮用水饲养，用于下一步的实验。造模期间有4只大鼠死亡，7只大鼠血糖值偏低，未列入实验对象。
1.2 动物分组及给药方法
成模的51只dm大鼠随机分为dm模型组15只，氨基胍（ag）（40 mg·kg-1·d-1）组、ta低高剂量（20及30 mg·kg-1·d-1）组各12只。药液的配制：ag及ta均购自sigma公司，注射前用0.1 mol/l pbs溶液配制2%ag溶液及1%ta溶液，以naoh调整溶液ph7.0，超净台下用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。正常对照组和模型组每天给予等剂量的生理盐水，各组给药方式均为腹腔注射，为期10 w。实验期间动物自由进食饮水，未使用胰岛素及其他降糖药物。
1.3 观察指标及方法
①每日观察动物精神状态、毛色、饮食情况、尿量、活动情况，每周称量一次各组大鼠体重。②分别于给药第2、4及10周后尾静脉取血，利用北京诒成血糖仪检测血糖水平。③实验结束时大鼠称重，取血后处死，立即摘取右肾称重，计算肾重/体重比值；血液生化指标的测定：处死动物后眼球取血，2 000 r/min离心10 min，吸取血清分装于eppendorf管中，采用日立7150型全自动生化仪检测各组大鼠血清肌酐（cr）、血尿素氮（bun）、尿酸（ua）；尿蛋白测定：给药10 w后处死动物，处死前将大鼠放入基础代谢笼内，禁食，不禁水，收集大鼠24 h尿液，记录尿量后留取3 ml，1 500 r/min离心10 min，去除沉渣，分装于eppendorf管中，采用日立7150型全自动生化仪检测尿蛋白（urine protein），计算24 h尿蛋白排泄量。④大鼠取血后处死，立即摘取肾脏，置于4%多聚甲醛中固定48 h，常规制备石蜡切片，行组织形态学检查，包括he、masson染色。同时各组取少量肾组织经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，eppon 812环氧树脂包埋，lkbⅲ型超薄切片机半薄切片定位后行超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，jem1200ex型透射电子显微镜观察、摄片，观察肾小球超微结构的变化。
1.4 统计学方法
数据用x±s表示，采用spss13.0软件进行组间方差分析。
2 结果
2.1 各组大鼠一般状况
正常对照组大鼠饮食饮水及二便正常，精神状态良好，毛色光润，反应敏捷，体重增加，无死亡。注射stz造模后72 h，大部分大鼠出现多饮、多尿，活动减少，体毛枯燥无光泽，精神萎靡，反应迟钝，拱背蜷卧。实验期间及结束，模型组大鼠“三多一少”症状未得到缓解，体重明显降低，体毛松散无光泽，状态差，死亡7只。ag及ta组大鼠也有相似的表现，但活动较模型组活跃，实验后期饮水及尿量有所减少。死亡情况为：ag组死亡4只，ta低剂量组死亡3只，ta高剂量组死亡5只，两种药物治疗组之间无明显差别。
2.2 各组大鼠肾脏指数的变化
dm大鼠体重明显减轻，肾脏体积增大，重量增加，明显大于正常对照组（p<0.01）。ta组大鼠体重减轻程度不如模型组明显，肾脏肾体积和重量较模型组显著降低（p<0.01），ta高低剂量组与ag组无明显差别。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)
2.3 ta对不同病程的大鼠血糖的影响
各组dm大鼠空腹血糖明显高于正常对照组（p<0.01），与模型组相比，ta处理2 w后，对dm大鼠的血糖改善不明显，随着治疗时间的延长，至第4周及实验结束（10 w），血糖明显降低。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)
2.4 各组大鼠肾脏功能的比较
各组dm大鼠血清cr、bun、ua含量和24 h尿蛋白排泄量均明显高于正常对照组，ta处理10 w后的dm大鼠，血cr、bun和尿蛋白排泄量均有不同程度改善。见表1。表1 各组大鼠体重、肾重、肾重/体重、不同病程大鼠血糖水平及生化指标的比较 (略)
2.5 各组大鼠光镜和电镜观察结果
光镜下见模型组肾小球体积增大，系膜基质增生，肾小囊腔呈裂隙状，肾小管管腔扩张，上皮细胞空泡变性和间质轻度纤维组织增生。ta组较模型组有很大程度改善，肾小球体积增大不明显，仅有轻度系膜增生。见图1。电镜观察下，正常对照组肾小球基膜内、中、外三层结构清晰、完整，基膜不增厚，系膜区不扩大，系膜基质无明显增多，血管内皮细胞、足细胞、系膜细胞未见异常，上皮足突分布均匀。肾小管上皮细胞未见肿胀及细胞核、细胞器的改变。模型组大鼠肾小球基膜三层结构不清，肾小球基底膜呈节段性明显增厚，并可见云雾状电子致密物沉积，内皮细胞局部增生呈连拱状改变，部分上皮细胞足突融合。肾小管细胞核内染色质边集，胞内溶酶体增多、部分变性，线粒体肿胀，嵴断裂，空泡化。ta组可见少量基膜呈节段性增厚，足突基本正常，系膜细胞及基质未见明显增生，部分肾小管可见胞体内溶酶体增多，其余部分未见明显异常。见图2。
3 讨论
dn是dm微血管病变所致，其发病机制比较复杂〔3〕。早期dn的主要表现为肾脏肥大和肾小球高滤过，肾小球结构出现改变，基膜增厚和系膜基质增多，尿白蛋白排泄率正常或出现微量白蛋白尿。随着病情的进展，肾小球滤过率开始下降，出现大量白蛋白尿，基膜增厚和系膜基质增加更加明显，临床出现进行性增加的非选择性蛋白尿，肾功能逐渐减退，至终末期也即尿毒症期，多数肾单位闭锁，血尿素氮、肌酐升高，血压升高。有效地防止或延缓dn的发生、发展，是延长dm患者寿命、提高其生活质量的重要措施。
一次足量给予动物stz可造成胰岛β细胞大量破坏，胰岛素合成和分泌减少，引起糖代谢紊乱，从而导致dm。本实验造模成功，在整个实验过程中，dm模型组大鼠的血糖稳定在较高的水平，多饮多食多尿，体重减轻等dm症状明显，至实验结束时，dm大鼠肾脏重量和肾肥大指数及血清cr、bun、尿蛋白水平等均较正常对照组明显增加，电镜下见肾小球基膜节段性增厚，电子致密物沉积和部分足突融合。表明成模的dm大鼠已进入早期dn阶段。给予ta后，治疗组大鼠的一般状态较模型组有所好转，肾脏的病理改变明显减轻，肾脏重量和肾肥大指数较dm组显著降低。chandak等〔4〕研究显示，dm大鼠用ta处理4 w后，可显著降低血糖，但没有明显改善血清cr及尿蛋白排泄水平。本实验结果发现ta处理10 w不但可以明显降低dm大鼠的血糖水平，而且对血清cr、bun及尿蛋白均有一定改善作用。以上实验结果表明，ta对dm大鼠具有一定的肾脏保护作用，能减轻肾脏肥大、基膜增厚等早期dn病理改变，降低尿白蛋白，从而延缓dn的进展和恶化。
dn的发病一般认为是多因素所致，主要包括代谢紊乱、肾小球血流动力学改变和遗传易感性等，其中高血糖可能是dn的始动因素〔5〕。以往的研究认为，某些中药或食物中的ta成分，具有降低血糖、血压及尿酸，调整脂代谢等作用〔6〕，本实验表明ta可以有效控制dm大鼠的血糖，因此我们推测ta对dm大鼠肾脏病理改变的减轻作用可能是通过其对糖代谢的调节，控制血糖而使dn得到逆转。目前已知，dn的发病与氧化应激、硝基应激及dm肾脏微炎症密切相关〔7〕，具有抗炎、抗氧化作用的ta改善肾功能的作用是否是通过改善dm的氧化及硝基应激状态，减轻dn的炎症反应，有待于近一步研究。此外，多聚(adp核糖)聚合酶（parp）的激活在dn的发病过程中扮演着重要的角色，使用parp抑制剂可以有效改善dm大鼠肾脏功能，降低dm的氧化应激水平〔8〕，shevalye等〔9〕使用一种名为gpi154,27的parp抑制剂，结果发现其可以降低转化生长因子（tgf）β、血管内皮细胞生长（vegf）、纤连蛋白的表达，但对icam1、硝基应激水平等没有明显改善，提示不同种parp抑制剂的联合应用将对dn的防治具有重要意义。有文献报道〔4〕，ta同样可以作为parp的抑制剂，防止其激活，但具体的作用机制尚不明确。总之，深入探讨ta在防治dn方面的作用，有望为临床防治dm并发症提供新的思路和应用。
【参考文献】
1 wolf g，chen s，ziyadeh fn，et al.from the periphery of the glomendar capillary wall toward the center of disease.podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy〔j〕.diabetes，2005；54:162634.
2 张 杰.鞣质的药理作用抗氧化、降脂、降压等多种作用〔j〕.国外医药·植物药分册，1995；10(3):99103.
3 kanwar ys，wada j，sun l,et al.diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression〔j〕.exp biol med，2008；233(1):411.
4 chandak pg，gaikwad ab，tikoo k,et al.gallotannin ameliorates the development of streptozotocininduced diabetic nephropathy by preventing the activation of parp〔j〕.phytother res，2009；23(1):727.
5 kikkawa r，koya d，haneda m，et al.progression of diabetic nephropathy〔j〕.am j kidney dis，2003；92 (9):1650.
6 姚思宇，赵 鹏.鞣质降血脂作用的动物实验研究〔j〕.中国热带医学，2004；4(6):9456.
7 万 静，刘丽梅.氧化应激抗氧化系统与糖尿病肾病〔j〕.国际内分泌代谢杂志，2006；26(4):1820.
8 szabó c，biser a，benko r，et al.poly(adpribose) polymerase inhibitors ameliorate nephropathy of type 2 diabetic leprdb/db mice〔j〕. diabetes，2006；55(11):300412.
9 shevalye h，stavniichuk r，xu w，et al.poly(adpribose) polymerase (parp) inhibition counteracts multiple manifestations of kidney disease in longterm streptozotocindiabetic rat model〔j〕.biochem pharmacol，2009；27.〔epub ahead of print〕.
