【关键词】 锦灯笼;肺腺癌;spca1细胞;细胞周期;凋亡
【摘要】 目的 探讨锦灯笼对人肺腺癌细胞株(spca1)的增殖抑制作用及其对细胞增殖周期和凋亡的影响。方法 应用mtt法、流式细胞术检测不同浓度的锦灯笼对spca1 细胞周期增殖及凋亡的影响。结果 锦灯笼对spca1有明显的生长抑制作用，且呈剂量时间依赖性，最大抑制率可达79.9%。锦灯笼可阻滞spca1细胞的细胞周期,使g1/g0期细胞增多,s 期细胞减少,同时诱导spca1细胞的凋亡,凋亡率最高可达35.5%。结论 锦灯笼抑制spca1细胞生长,其抑制作用可能是通过锦灯笼使细胞周期抑制于g1/g0期和诱导细胞凋亡而实现的。
锦灯笼又名酸浆、红姑娘、灯笼草等，主要成分为酸浆苦素等。目前国外有多篇报道酸浆苦素类物质具有体内外抗肿瘤活性，antoun等发现体外试验中，酸浆苦素b和表二氢酸浆苦素c都能抑制肿瘤细胞生长;在小鼠体内试验中，酸浆苦素b有中度抗白血病细胞的活性，对肿瘤有一定的抑制作用,但目前锦灯笼抗肿瘤的作用机制尚不明确。本研究观察了锦灯笼对体外培养的人肺腺癌细胞株spca1增殖周期的抑制作用及其对细胞内凋亡的影响,旨在探讨锦灯笼抗肿瘤作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 锦灯笼(长春世一堂药店);spca1(吉林省肿瘤研究所);mtt/噻唑蓝(sigma美国);酶标仪(biorad model 550美国);co2培养箱(napco model 6100 美国)。Www.11665.Com
1.2 方法
1.2.1 锦灯笼水煎液制备 将锦灯笼2.5 g加入250 ml温水中浸泡60 min，急火烧开后文火煎20 min得首次水煎液，重复1次得2次水煎液，将两次所得水煎液合并后文火浓缩成50 ml，得5%锦灯笼水煎液(按所含生药量计算)，6层纱布滤去沉渣，g5滤器过滤除菌后分装，-20℃保存。
1.2.2 mtt法检测细胞抑制率 将生长状态良好的spca1调成1×105/ml，接种于96孔培养板内，0.1 ml/孔，过夜贴壁后分组。加药组：将5%锦灯笼水煎液倍比稀释成2、4、8、16、32倍5个稀释度，浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/ml，分别加入接种有spca1细胞的96孔培养板内，0.1 ml/孔，每个浓度设3个平行孔。对照组：加全培基0.1 ml/孔，设6个平行孔。37℃、5% co2条件下培养24 h，结束培养前4 h加入mtt(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养4h后吸弃上清，加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min使mtt还原物溶解，用酶标仪测570 nm a值，统计均值及标准差，按下式计算spca1细胞的抑制率。抑制率(ir)=〔(对照孔细胞a值加药孔细胞a值)/对照孔细胞a值〕×100%。
1.2.3 流式细胞仪(fcm)测定锦灯笼对人肺腺癌细胞spca1细胞周期的影响 将人肺腺癌细胞spca1细胞接种于6孔板,加入含不同浓度的锦灯笼(25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/ml)。于24 h 后，胰酶消化,收集细胞,调细胞浓度为1×106个/ml，用pbs 缓冲液洗涤3 次,离心10 min,弃上清液,用70%的酒精固定过夜,用1 mg/ml rnasea消化,离心,加碘化丙啶(pi)染色,经300目尼龙网筛滤,fcm进行dna细胞周期分析。
1.2.4 fcm测定spca1对人肺腺癌细胞spca1细胞凋亡的影响 其具体方法同细胞周期分析,经300目尼龙网筛滤,fcm进行细胞凋亡分析。
1.3 统计学分析 数据以x±s表示。采用spss 统计软件包,组间比较采用方差分析,两组间的差异比较采用q检验。
2 结 果
2.1 酸浆对肺癌细胞生长的抑制作用 不同浓度的锦灯笼对spca1细胞生长均有抑制作用，当锦灯笼水煎液浓度为6.25 mg/ml时对人肺腺癌细胞的抑制率可达50%以上，锦灯笼水煎液浓度为25 mg/ml时抑制率可达到79.9%，与对照组比较差异有显著性。提示锦灯笼水煎液对人肺腺癌细胞具有较好的体外抑制作用，抑制率随药物浓度的增加而升高(p<0.01)。见表1。
2.2 锦灯笼对肺癌细胞细胞周期的影响 加入不同浓度锦灯笼培养spca1细胞24 h后,锦灯笼3.125、1.562 5 mmol/l对其细胞周期无明显影响,而6.25、12.5和25 mmol/l锦灯笼对其细胞周期有明显影响。见表2。
2.3 锦灯笼对肺癌细胞细胞凋亡的影响 spca1 细胞经不同浓度的锦灯笼作用24 h后,出现凋亡峰(a)。图1所示25、12.5、6.25 mg/ml锦灯笼作用spca1细胞的凋亡率分别为30.5%,14%,10.3%,呈剂量依赖性(p<0.01)。表1 锦灯笼水煎液对spca1细胞抑制作用 表2 不同浓度锦灯笼对肺癌细胞周期的影响1：未加药spca1细胞周期分布;2：dmso spca1细胞周期分布;3：6.25 mg/ml spca1细胞周期分布;4：12.5 mg/ml spca1细胞周期分布;5：25 mg/ml spca1细胞周期分布图1 不同浓度锦灯笼水煎剂对肺癌细胞凋亡的影响
3 讨 论
锦灯笼化学成分为酸浆苦素a、 b、 f 、d、m等〔1，2〕。 研究发现锦灯笼水提物在小鼠体内具有抗癌细胞的活性，其主要原因可能是水提物可以阻断柠檬酸循环，酸浆苦素b、f和h对人及鼠肿瘤细胞株均有细胞毒性〔3〕。酸浆苦素b、f、g可降低脂多糖及infγ刺激的巨噬细胞释放一氧化氮。在酸浆苦素b存在的情况下，在脂多糖及infγ刺激下的巨噬细胞产生更低水平的tnfα、il6及il12〔4〕，对正常细胞起到保护机制。酸浆苦素f和b对人肺腺癌细胞株(spca1)有抑制作用，f作用更强〔5，6〕。酸浆苦素b和f在16 mmol/l和8 mmol/l浓度下抑制人肺腺癌细胞株(spca1)诱导nfκb活化的pma活性;在24 h后诱导该细胞凋亡。酸浆苦素f在5 mmol/l浓度下通过经典途径抑制诱导nfκb活化的tnfα活性〔7〕。酸碱苦素b在接种肉瘤肿瘤细胞体内试验显示出了抗肿瘤作用，抑制肿瘤的增殖，降低了动物体内ki67染色的表达〔8〕。
本实验结果显示，6.25 mg/ml浓度的锦灯笼水煎液对肺癌细胞spca1增殖的抑瘤效应即非常明显，可能对肺癌的治疗有一定作用，其作用机制有待于进一步研究探讨。
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