单核细胞源性泡沫细胞trem1的表达
【摘要】 目的 探讨髓系细胞触发受体1(trem1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxldl)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况。方法 先后用pma、oxldl诱导人u937细胞，使其转化为泡沫细胞。用rtpcr法及western印迹法检测pma诱导组、低密度脂蛋白（ldl）组和oxldl组细胞中trem1 mrna及蛋白的表达。结果 与pma诱导组、pma+ldl组细胞比较，pma+oxldl组细胞trem1 mrna及蛋白表达水平均明显增高（p<0.05）。结论 trem1可能参与泡沫细胞的形成，与动脉粥样硬化（as）斑块的发生发展密切相关，可能成为as治疗的一个新的靶点或监测as进展的一项新指标。
【关键词】 泡沫细胞；髓系细胞触发受体1；动脉粥样硬化
泡沫细胞是动脉粥样硬化（as）斑块内出现的特征性病理细胞，主要来源于血液单核细胞与血管中膜平滑肌细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。u937是一种人淋巴瘤细胞，本质是单核细胞，体外细胞培养呈悬浮生长，经佛波酯刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，后者在含氧化型低密度脂蛋白胆固醇（oxldl）的培养液中培养可转化为泡沫细胞〔1〕。髓系细胞触发受体1（triggering receptor expressed on myeloid cells1，trem1）是一个30 ku的糖蛋白，能诱使多种炎性因子和化学因子如肿瘤坏死因子α（tnfα）、白介素8（il8）和单核细胞趋化蛋白1（mcp1）的生成。Www.11665.COm因此，trem1在调节中性白细胞和单核细胞的激活过程及炎症反应中处于较重要地位。但有关trem1在单核细胞源性泡沫细胞中表达情况未见报道。本研究用pma及oxldl诱导u937细胞向泡沫细胞转化，用rtpcr及western 印迹法探讨trem1在此过程中的表达情况。
1 材料与方法
1.1 细胞来源及主要试剂
u937细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司，系人单核细胞系，倍增时间为24～48 h，在含10%小牛血清rpmi1640培养基中呈悬浮样生长。
oxldl由yuanyuan biotechnology提供。佛波酯购自sigma公司。rpmi1640培养基和trizol购自gibco公司。mmlv逆转录酶、taq dna聚合酶、10 mmol/l dntp、oligo（dt）购自fermentas公司。小鼠抗人trem1单克隆体为abnova公司产品，兔抗人gapdh抗体为santa cruz产品。ecl发光试剂盒为millipore公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 u937细胞的分化及诱导
呈对数生长的u937细胞（细胞密度1.0×109/l），加入终浓为100 nmol/l pma，孵育72 h，使其由单核细胞分化为巨噬细胞样u937细胞。用无血清培养液培养12 h后，换成含oxldl(终浓度为100 mg/l)的培养液继续培养24 h，将上述巨噬细胞样u937细胞诱导为泡沫细胞。
1.3 油红o染色法鉴定u937泡沫细胞
将贴壁生长的细胞用新鲜配制的0.3％油红o染色20 min，苏木素染色5 min，70％乙醇脱色及返蓝后，水溶性胶封片，镜下观察结果。
1.4 实验分组
将经pma诱导的u937细胞平均分为3组，分别为pma诱导组，pma+低密度脂蛋白（ldl）组和pma+oxldl组。每组设5个孔，分别用正常含10%小牛血清的rpmi 1640培养液、含ldl终浓度为100 mg/l的培养液及含oxldl终浓度为100 mg/l的培养液培养24 h，收集培养细胞进行rtpcr检测及western印迹检测。
1.5 rtpcr法检测培养细胞中trem1 mrna的表达
按trizol说明书提取培养细胞总rna，按逆转录酶提供的说明书进行逆转录反应。取逆转录模板2 μl用于pcr，反应条件为cdna预变性94℃ 5 min后，经94℃ 30 s，55℃ 30 s；72℃ 30 s共30个循环；循环结束后再72℃延伸10 min。反应结束后取pcr产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品pcr产物扩增的特异性片段进行积分光密度扫描。以gapdh密度作参考定量标准，各组光密度与其比值表示表达量强弱。
根据genbank提供数据设计引物。trem1引物上游序列为5′tgctgtggatgctctttgtc3′，下游序列为5′cacagttctggggctggtat3′，扩增片段长度为491 bp；gapdh引物上游序列为5′accacagtccatgccatcac3′，下游序列为5′tccaccaccctgttgctgta3′，扩增片段长度为452 bp。以上引物均由上海捷瑞公司合成，用te缓冲液稀释成终浓度为15 pmol/l，-20℃贮存备用。
1.6 western印迹法检测培养细胞中trem1蛋白的表达
将培养细胞用细胞裂解液收集并充分裂解后，进行10% sdspage电泳，电转膜，丽春红染色，观察转膜效果；以pbst洗膜15 min，共4次，室温下2% 脱脂奶粉封闭1 h；分别加适当稀释的一抗（trem1按1∶500稀释，gapdh按1∶2 000稀释）4℃孵育过夜；pbst洗膜15 min，共4次，加二抗（hrp标记的羊抗鼠igg）室温2 h；pbts充分洗膜，用ecl试剂盒化学发光检测，gapdh为内对照，用图像分析仪分析各组条带光密度值。
2 结 果
2.1 泡沫细胞的形态学鉴定
u937细胞经过pma诱导72 h后，倒置显微镜下观察，多数细胞由圆形变成多角形，并易于聚集、贴壁，表明细胞已由单核细胞分化后具有巨噬细胞样特征。经oxldl油红染色后可见培养细胞明显显示出泡沫样改变，胞浆内较多的脂滴颗粒存在，且发现由于个别细胞吞噬了过多脂滴而致细胞体积增大（见图1），而未加oxldl的对照组细胞及ldl对照组细胞内无明显脂滴颗粒。
2.2 trem1 mrna及trem1蛋白在泡沫细胞中的表达
rtpcr结果显示，trem1扩增产物为492 bp。结合western印迹结果显示，与pma组及pma+ldl组比较，pma+oxldl组trem1 mrna及trem1蛋白表达量明显增加（p<0.05）；而pma组与pma+ldl组比较，差异不显著（p＞0.05），见图2，图3及表1。表1 trem1 mrna及蛋白表达结果（略）
3 讨 论
as是一个复杂的炎症免疫反应病理过程，as斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、oxldl负载的巨噬细胞（即泡沫细胞）和t淋巴细胞等炎性反应细胞浸润〔2〕。病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞，后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与oxldl结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。同时，巨噬细胞吞噬oxldl形成泡沫细胞时可生成血管内皮生长因子（vegf）、tnfα等细胞因子，这些因子在as的发生发展中起着关键作用〔3，4〕。近年来的研究发现，肺炎衣原体、幽门螺杆菌、巨细胞病毒等病原体通过激活炎症反应及损伤内皮而促进冠心病的发生发展〔5〕，提示as与感染性疾病的发病机制可能密切相关。
trem1属免疫球蛋白超家族成员，能显著放大由脂多糖（lps）等细菌产物引发的急性炎症反应，在感染性休克发生中具有重要作用，因而引起越来越多研究者的关注。研究表明，trem1不仅与细菌感染相关的急性炎症有关，在一些病毒感染性炎症、非特异性慢性炎症、缺血再灌注损伤、烧伤、甚至肿瘤的复发及预后判断方面都有重要作用〔6，7〕。
u937本质上是人单核细胞，经佛波酯、oxldl刺激后可以分化为巨噬细胞样细胞，进而转化为巨噬细胞源性泡沫细胞。u937的这一特性使其成为体外研究泡沫细胞形成机制的重要工具。本研究用rtpcr法及western印迹法对u937向泡沫细胞转化过程中trem1 mrna及蛋白表达情况进行检测，结果发现单核细胞在向泡沫细胞转化过程中表达量不断增加，提示trem1参与泡沫细胞的形成，可能与as斑块的发生发展密切相关。因此trem1可能成为as治疗的一个新的靶点或监测as进展的一项新指标。
【参考文献】
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