作者：曹洪昭 聂传平 李红玉
【摘要】 目的：建立一种测定万寿菊茎中叶黄素含量的hplc方法。方法：采用diamonsilc18 色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇∶水=97.5∶2.5，流速：1.0 ml/min，检测波长：445 nm。结果：叶黄素在1.92～96 μg/ml范围内，有良好的线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为98.9%，rsd1.04%。结论：该法简便准确、重现性好，可用于万寿菊茎中叶黄素的含量测定。
【关键词】 万寿菊茎; 叶黄素; 高效液相色谱; 含量测定
叶黄素(lutein)是胡萝卜素的衍生物，是一种优良的抗氧化剂，在老年性黄斑退化病和白内障疾病防治方面具有重要的作用[1，2]。此外，叶黄素还具有预防心血管疾病、抗癌和提高机体免疫力等功能[3]。1g叶黄素的价格与1 g黄金的价格相同，因此又名“植物黄金”。目前叶黄素主要从万寿菊干花中提取、检测，而对万寿菊茎中叶黄素含量的测定研究未见报道。我国在新疆、内蒙古、黑龙江等地区建立了大面积的万寿菊种植基地，但是大量的万寿菊茎、叶被作为废弃物而未被利用。WwW.11665.COM因此，研究、开发富含叶黄素的新天然资源，测定万寿菊茎中叶黄素的含量具有重要的现实意义。同时，为广大万寿菊种植者和加工企业变废为宝，做一点有益的探索。
1 仪器与试药
1.1 仪器
uv2550紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);re5298a旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);p680型高效液相色谱仪(戴安中国有限公司);skq2200超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司);d2f6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2 试药
实验所用万寿菊茎采自辽宁医学院药园，采摘后切碎、洗净，常温干燥至恒重，粉碎过20目筛以备用;叶黄素对照品(上海顺勃生物工程技术有限公司，含量≥95%)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的配制
精密称取叶黄素标准品4.8 mg置25 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。置于阴凉避光处保存。
2.2 供试品溶液得配制
2.2.1 提取 取万寿菊茎适量，研磨成粉末，过20目筛，称取粉末10 g置于500 ml烧瓶中，加入石油醚∶无水乙醇(3∶l)混合溶剂250 ml，提取温度50℃，超声振荡提取20 min。过滤，除去滤渣，将滤液置于分液漏斗中。分离石油醚层，将其旋转蒸发浓缩。
2.2.2 皂化 在浓缩液中加人20%的氢氧化钾甲醇溶液5 ml，60℃水浴加热，反应6小时。用10%的盐酸调节ph值至中性，过滤，滤渣用适量的冷水和正己烷洗涤。
2.2.3 重结晶 将2.2.2项下制得的滤渣溶于二氯甲烷中制得饱和溶液，向饱和溶液中慢慢逐滴加入适量的正己烷，放入冰箱中于5℃静置过夜。次日，在4000 r/min的条件下离心10 min，得到的沉淀物用氮气吹干，用甲醇溶解于100 ml棕色容量瓶中，摇匀，得供试品溶液，阴凉避光保存。
2.3 色谱条件的考察
色谱柱：diamonsilc18(200 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇∶水= 97.5∶2.5;流速：1.0 ml·min-1;检测波长：445 nm;柱温：室温(25℃);进样量：20 μl;定量方法：外标法;理论塔板数以叶黄素峰计算，不低于8000。
2.4 线性关系的考察
精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 ml，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样量20 μl。以峰面积(y)为纵坐标，叶黄素浓度(x)为横坐标建立标准曲线，回归方程为y=0.785 x +1.346 6 ，r2=0.9996。由图1可知叶黄素浓度在1.92～96 μg/ml范围内，呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密移取叶黄素标准品溶液(28.8 μg/ml)重复进样6次，测得叶黄素峰面积，实验结果见表1，结果显示6次测定叶黄素峰面积的rsd为1.7 %。
2.6 稳定性试验
精密移取叶黄素标准品溶液(28.8 μg/ml)，每隔2 h测1次其中的叶黄素含量。试验结果见表2。结果表明，在10 h内叶黄素含量没有发生显著变化，保持稳定。
2.7 重复性试验
精密移取叶黄素标准品溶液(28.8 μg/ml)，重复进样6次，测叶黄素峰面积，实验结果见表3。结果显示，6次测定叶黄素峰面积的rsd为0.81%。
图1 叶黄素的hplc标准曲线表1 精密度试验结果表2 稳定性试验结果表3 重复性试验结果
2.8 加样回收率试验
取6份已知浓度的叶黄素样品溶液各5 ml，分成3组并分别加入不同量的叶黄素标准品，定容至10 ml，进样量为20 μl。按上述色谱条件进行测定，计算得叶黄素的回收率在97.1%～100.2%之间，平均回收率为98.9%，rsd为1.04%。
2.9 标准品、样品色谱图
见图2、图3所示。
2.10 样品含量的测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20 μl进样，重复测定3次，求叶黄素峰面积的平均值，按外标一点法计算含量。表4 加样回收率试验结果表5 产品纯度测定的计算结果
3 讨论
本试验比较了不同提取溶剂(正己烷、丙酮、无水乙醇、石油醚、四氢呋喃等)对叶黄素提取效果的影响，确定石油醚∶乙醇=3∶1为最佳提取溶剂。
万寿菊茎中富含叶黄素，测定结果说明：其含量达75.42 mg/100 g，而文献报道羽衣甘蓝中叶黄素的含量为13.644 mg/100g[4]。万寿菊茎是分离叶黄素的理想原料药。
本实验从提取方法到仪器分析的色谱条件都做了较多的筛选和摸索，在确保目标组分与其它组分良好分离的前提条件下，充分考虑了流动相的成本、毒性及后处理操作难易程度等因素，选择了甲醇∶水=97.5∶2.5为本方法的流动相体系。结果表明，此法具有较高的准确度和良好的重现性，干扰少，可用于万寿菊茎中叶黄素的含量测定。
【参考文献】
1 krinsky ni, landrum jt, bone ra. biologic mechanisms of the protective role of lutein and zeaxanthin in the eye. annu rev nutr, 2003， 23: 171～201.
2 krinsky ni. possible biologic mechanisms of a protective role of xanthophylls. nutr, 2002, 132 (3): 540～542.
3 maresperlman ja, millen ae, fieck tl, et al. body of evidence to support a protective role for lutein and zeaxanthin in delaying chronic diseases. j nutr, 2002, 132 (3): 518～524.
4 杨麦生, 姬秀芝, 王向东. 羽衣甘蓝叶黄素浸提方法及性质的初步研究. 食品研究与开发, 2006, 27(9): 21～23.
