【摘要】 目的 研究大黄中5种羟基蒽醌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。方法 采用ph梯度萃取法从大黄中提取出蒽醌成分,采用体外实验及二分法测定各成分的抑菌效果。结果 大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用,大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好,芦荟大黄素次之,大黄酸最差。结论 大黄具有抑菌作用。
【关键词】 大黄；金黄色葡萄球菌；二分法
abstract：objective to study the effect of five free anthraquinones of rheum on staphylococcus aureus. method total anthraquinones was extracted by ph grades extraction, and the effect on restraining bacterium was measured by bisection method. result emodin, aloe-emodin, rhein has the effect of restraining bacterium, chyrsophanol and physcion has not the effect of restraining bacterium. of the effect on restraining bacterium, emodin is the best, then is aloe-emodin, rhein is the worst. conclution rheum has the effect of restraining bacterium. key words：rheum；staphylococcus aureus；bisection method 现代药理研究证明,大黄具有抗菌、抗肿瘤、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。wwW.11665.cOM大黄中含有的最主要的5种羟基蒽醌是：大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。本实验主要通过对这5种羟基蒽醌的提取、分离及对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行比较,旨在为大黄在抗菌方面的应用提供一定的实验依据。
1 实验材料
大黄购于沈阳中街新药特药,金黄色葡萄球菌staphy- lococcus aureus 209p购于辽宁省药品检验所。
2 方法与结果
2.1 大黄总蒽醌的提取[1]
称取25 g的大黄粗粉,置于圆底烧瓶中,先加入50 ml的20%硫酸,再加入125 ml的氯仿,75 ℃回流4 h。
2.2 游离蒽醌的分离[2]
本实验采用ph梯度萃取法进行分离。氯仿总提取液50 ml,加ph 8的缓冲液17 ml,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至ph 3,静置,沉淀,抽滤得大黄酸,用冰醋酸重结晶得大黄酸精品。剩余氯仿层加ph 9.9的缓冲液30.5 ml,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至ph 3,静置,沉淀,抽滤得大黄素,用冰醋酸重结晶得大黄素精品。剩余氯仿层加ph 13的缓冲液60 ml,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至ph 3,静置,沉淀,抽滤得芦荟大黄素,用冰醋酸重结晶得芦荟大黄素精品。剩余氯仿层回收氯仿,得大黄酚与大黄素甲醚混合物。
2.3 提取物溶液的配制
将各提取物用其相应的缓冲液配制成浓度6 mg/ml的溶液。
2.4 大黄中5种游离蒽醌抑菌作用的检验
2.4.1 培养基的制备
牛肉浸膏0.15%,酵母浸膏0.6%,蛋白胨0.6%,葡萄糖0.1%,琼脂1.8%,ph 6.9～7.1,常水配制。
2.4.2 操作过程
制备50 ml培养基,灭菌30 min。在超净工作台上,先倒出30 ml至培养皿中,再于50 ℃左右向另外20 ml培养基中迅速加入0.6 ml菌悬液,混匀,倒入同一个培养皿中。待培养基凝固后,分别点上5 μl、浓度为6 mg/ml的各提取物溶液。在37 ℃恒温培养箱中培养10 h,然后进行美蓝染色。量取100 ml 95 %乙醇,加浓盐酸1滴,即为酸性乙醇。量取100 ml 95%乙醇,加氢氧化钠2 g,振摇,待溶解后即为碱性乙醇。取美蓝溶液20 ml倒入平板中,用三角耙涂匀,2 min后倾去,倒入酸性乙醇20 ml,2 min后倾去,倒入碱性乙醇20 ml,2 min后倾去。细流自来水冲洗3 min,倾去并吸干浮水,快速贴上滤纸1张,用三角耙赶走气泡,10 min后揭下滤纸,晾干。5种游离蒽醌抑菌圈直径：大黄酸为5 mm,大黄素为9 mm,芦荟大黄素为3 mm,大黄酚与大黄素甲醚混合物为0 mm。
2.4.3 二分法测定各提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度[3]
准备16支试管,其中1支作为空白对照组,其余15支平均分成3组,分别代表3种不同的成分,每组分成ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ号,并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配制成不同浓度的提取物溶液,向试管中加入培养基(配方与2.4.1相同,但不加琼脂),将培养基与提取物溶液充分混合后,灭菌。最后在超净工作台上分别向3组试管中(除空白对照组)分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液。具体加入量见表1～表3。培养24 h酸的ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ号试管全部长菌,只有ⅰ号试管没有长菌；芦荟大黄素的情况与大黄酸一样,只有ⅰ号试管没有长菌。大黄素的抑菌作用最好,ⅰ、ⅱ管都没有长菌,ⅲ、ⅳ、ⅴ号试管全部长菌表1 大黄酸不同浓度溶液的抑菌作用（略）表2 大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）表3 芦荟大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）
3 讨论
二分法具有简便、准确、省时等特点。将待测成分按其前一个的一半浓度稀释,首先在数值计算上很方便,不用大量的计算；其次在配溶液时不容易弄乱出错,只进行稀释半倍即可；第三是在做出结果后,直接用肉眼就可以观察结果,方便快捷,无须动用其他仪器,节省时间。实验结果表明,大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用,大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好,芦荟大黄素次之,大黄酸最差。
【参考文献】
[1] 张 梅.中药化学基础.北京：化学工业出版社,2006.85.
[2] 袁倚盛.大黄游离蒽醌的制备与纯化[j].中草药,2000,31(7)：508.
[3] 郑钧镛.药品微生物学及检验技术[m].北京：人民卫生出版社,1989.149.
