【摘要】 目的 建立清开灵注射液中猪去氧胆酸的含量测定方法。方法 采用hplc法,色谱柱为ultimatexb-c18 (5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.1),流速为1 ml/min,柱温为40 ℃,检测波长为192 nm。结果 猪去氧胆酸在0.201 35～1.006 75 mg/ml范围内线性关系良好,r＝0.999 6,平均加样回收率为98.25%,rsd＝1.26%。结论 方法准确、可靠,重复性好,可用于清开灵注射液的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；清开灵注射液；猪去氧胆酸
abstract：objective to establish a method for content determination of hyodeoxycholic acid in qingkailing injection. methods an ultimatexb-c18 column (5 μm, 250 mm×4.6 mm) was used with a mobile phase of acetonitril-water-phosphoric acid (35∶65∶0.1). the flow rate was 1 ml/min. the temperature of the column was 40 ℃. the detection wavelength was 192 nm. results there was a good linear relationship between the concentration of hyodeoxycholic acid and absorption area value in range of 0.201 35～1.006 75 mg/ml, r＝0.999 6. the average recovery was 98.25% with rsd＝1.26%. conclusion this method was accurate, credible and repeatable which can be used to control the quality of qingkailing injection.
key words：hplc；qingkailing injection；hyodeoxycholic acid
清开灵为安宫牛黄丸改良的复方注射液,具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍之功,用于热病神昏、中风偏瘫、神志不清,亦可用于急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸道感染、肺炎、高烧以及脑血栓形成、脑出血见上述证候者。wwW.11665.COM其原方中牛黄具有镇静开窍的作用,主要成分为胆酸和猪去氧胆酸,二者具有与牛黄相似的药效活性[1]。清开灵注射液已收录于2005版《中华人民共和国药典》(一部),其中含量测定包含了胆酸的测定方法[2]。由于胆酸和猪去氧胆酸均为清开灵注射液的活性成分,且结构相似,故而研究了同时测定胆酸和猪去氧胆酸的含量的方法,结果较好。
1 仪器与试药
waters 2695高效液相色谱仪。胆酸对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号10078-0013),猪去氧胆酸对照品(sigma,纯度98%)；清开灵注射液(市售样品3批, 10 ml/支,吉林省集安益盛药业股份有限公司生产)。乙腈为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
参考2005版《中华人民共和国药典》(一部)清开灵注射液中胆酸含量测定的色谱条件[2]。经比较色谱峰分离情况以及分离度,确定的色谱条件为色谱柱ultimatexb-c18 (5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.1),流速为1 ml/min,柱温为40 ℃,检测波长为192 nm。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取猪去氧胆酸对照品适量,加60%乙腈制成每1 ml含2.013 5 mg的溶液,作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密量取本品10 ml,加稀盐酸0.5 ml,用醋酸乙酯提取4次(20、20、15、15 ml),合并醋酸乙酯液,蒸干,残渣加60%乙腈适量使溶解,并转移至25 ml量瓶中,用60%乙腈稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性溶液的制备
取缺胆酸、猪去氧胆酸的阴性制剂,按供试液溶液制备方法制备,即得。
2.3 专属性试验
分别吸取猪去氧胆酸对照品溶液、供试品溶液与阴性溶液,按上述色谱条件进行检测,结果供试品、猪去氧胆酸对照品在相应时间出现猪去氧胆酸特征吸收峰,阴性溶液无干扰吸收峰。结果见图1。
2.4 标准曲线及线性范围
分别精密吸取猪去氧胆酸对照品溶液1、2、3、4、5 ml,加60%乙腈稀释至10 ml,在上述色谱条件下,进样10 μl,测定峰面积值。以峰面积平均值和对照品溶液浓度进行回归处理,回归方程为：a＝5.755 10×105c－2.114 200×103,r＝0.999 6；猪去氧胆酸在0.201 35～1.006 75 mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5 最低检测限
取0.201 35 mg/ml的对照品溶液用60%乙腈稀释1倍,得0.101 675 mg/ml的溶液,取10 μl进样测定,s/n＝3,故最低检测限为1 μg。
2.6 精密度试验
取浓度为0.604 05 mg/ml对照品溶液10 μl进样测定,连续6次,结果rsd＝1.6%。
2.7 重复性试验
取清开灵注射液样品,按照“2.2.2”项下方法制备供试液,平行试验6份,测定猪去氧胆酸的含量,结果rsd＝2.4%。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液,每隔2.0 h进样10 μl,测定猪去氧胆酸12 h内的峰面积值,结果rsd＝2.8%。
2.9 加样回收率试验
精密称取猪去氧胆酸对照品,配制成浓度为2.013 5 mg/ml对照品溶液。另取清开灵注射液(批号060102)5 ml,平行试验9份,分别加入对照品溶液,按上述色谱条件测定,结果见表1。 表1 加样回收率试验结果(略)
2.10 样品含量测定
取本品3批(批号分别为060101、060102、060103),按供试品溶液制备方法制备供试液,测定猪去氧胆酸的含量,结果见表2。表2 3批样品中猪去氧胆酸的含量测定结果(略)
3 讨论
醋酸乙酯振摇提取次数对猪去氧胆酸提取有一定影响,经试验考察,振摇提取3次可提取98%,提取4次可提取完全,结果与《中华人民共和国药典》中胆酸的提取相一致。
经试验,在上述色谱条件下,胆酸与猪去氧胆酸的分离度为3.7,可完全分离,因此,可同时测定这两个成分,更利于清开灵注射液的质量控制。本试验胆酸、猪去氧胆酸的含量测定方法均与药典中胆酸含量测定方法一致,考虑到胆酸含量测定方法已经比较成熟,因此,未做胆酸含量测定的方法学考察。
因胆酸和猪去氧胆酸的检测波长为192 nm,为末端吸收,基线噪音较大。清开灵注射液中胆酸、猪去氧胆酸的含量较高,受到的影响较小,含量测定较准确。如为含量较低的药品,所受影响较大,可考虑采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定,已有文献报道,该方法猪去氧胆酸的最低检测限为5 ng[3]。对此,我们将做进一步研究。
【参考文献】
[1] 北京中医学院.北京中医学院三十年论文选[m].北京：中医古籍出版社, 1986.471－478.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2005.610.
[3] 曹 进,徐 燕,王义明,等.清开灵注射液中三种胆酸含量测定方法比较[j].中成药,2003,25(9)：705－708.
