【摘要】  目的 对贯叶金丝桃中总黄酮的提取工艺进行优选。方法 采用正交试验法,以总黄酮为指标,对乙醇浓度、溶剂量、提取时间及提取次数4种因素进行了研究。结果 将贯叶金丝桃用8倍70%乙醇提取3次,每次2 h,可以获得较高的提取率。结论 此工艺有效成分提取率较高,重复性好,稳定可行。

【关键词】  贯叶金丝桃；总黄酮；金丝桃苷；提取工艺

    abstract：objective to optimize the extraction process of total flavonoids in hypericum perforatum l.. methods the concentration and volume of alcohol, extraction time and frequency were systematically studied by the total flavonoids as the marker. results the more effective way to extract total flavones was extraction with 8 times amount of 70% alcohol under reflux for 3 times and 2 h for each time. conclusion this method obtains more effective components. it is stable and reliable.

    key words：hypericum perforatum l.；total flavonoids；hyperoside；extraction process
 
    贯叶金丝桃为2005年版《中华人民共和国药典》(一部)新增的药材品种,是藤黄科金丝桃属植物贯叶金丝桃hypericum perforatum l.的干燥地上部分,具有舒肝解郁、清热利湿、消肿止痛等功效,用于情志不畅、气滞郁闷、关节肿痛、小便不利等。Www.11665.com有研究表明,贯叶金丝桃总黄酮具有保肝、抗乙肝病毒和利胆作用,且其中的金丝桃苷效果最好。我们在以往研究的基础上,对贯叶金丝桃总黄酮的提取工艺进行了进一步的研究,现报道如下。

　　1  仪器与试药

    贯叶金丝桃hypericum perforatum l.购自亳州九方药材公司,产地为四川古蔺地区,安徽中医学院药学院中药教研室潘鲁敏副教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物贯叶金丝桃的上枝叶。金丝桃苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号111521-200303)。乙醇购自合肥酒精厂,其他试剂均为分析纯,重蒸馏水自制。

　　2  含量测定

　　2.1  金丝桃苷含量测定

    采用高效液相色谱法测定金丝桃苷的含量，计算金丝桃苷提取率。

　　2.1.1  对照品溶液的制备 

　　精密称取干燥至恒重的金丝桃苷对照品5.2 mg,置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成0.208 mg/ml金丝桃苷对照品溶液。

　　2.1.2  供试品溶液的制备 

　　取贯叶金丝桃提取物约40 mg,精密称定,加甲醇溶解后滤过,定容至50 ml量瓶中,制成供试品溶液。

　　2.1.3  标准曲线的绘制 

　　精密吸取金丝桃苷对照品溶液0.5、1、2、3、4 ml,分别用甲醇定容至10 ml,制得系列对照品溶液。分别进样20 μl,记录峰面积值y,以c为横坐标,y为纵坐标,得回归方程：y＝175 233c＋9 464.6,r＝0.999 9,说明金丝桃苷在10.4～83.2 μg/ml范围内具有良好的线性关系。

　　2.1.4  精密度试验 

　　取同一份对照品溶液,浓度为20.8 μg/ml,进样20 μl,重复6次,测定峰面积,结果rsd＝1.47%,说明精密度良好。

　　2.1.5  重复性试验 

　　取同一批贯叶金丝桃药材提取物6份,制备样品溶液,分别进样20 μl,测得峰面积rsd＝1.36%,表明该法重复性较好。

　　2.1.6  稳定性试验 

　　取供试品溶液,分别在0、2、4、6、8 h进样20 μl,测定峰面积,rsd＝1.24%,结果表明在8 h内样品溶液稳定性较好。

　　2.1.7  加样回收率试验 

　　精密称取已知金丝桃苷含量的贯叶金丝桃提取物40 mg,精密加入金丝桃苷对照品(0.235 mg/ml) 5 ml,依法制备供试品溶液。分别进样20 μl测定峰面积,计算回收率,结果见表1。表1  金丝桃苷加样回收率试验结果（略）
 
　　2.1.8  样品含量测定 

　　按供试品溶液制备方法制备样品溶液,精密吸取20 μl,注入高效液相色谱仪,测定金丝桃苷含量,见图1,计算金丝桃苷的提取率。

　　2.2  总黄酮含量测定
　
    采用nano2-al(no3)3-naoh比色法测定贯叶金丝桃总黄酮含量,计算总黄酮提取率。

　　2.2.1  测定波长的选择 

　　取金丝桃苷对照品、供试品溶液,比色后,进行紫外光谱扫描,其在510 nm附近有最大吸收峰,因此,选择510 nm作为检测波长。

　　2.2.2  测定方法
 
　　精密吸取甲醇、芦丁对照品溶液和供试品溶液1.0 ml,分别置于25 ml量瓶中,各加蒸馏水5 ml,摇匀；加5%nano2溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min；加10% al(no3)3溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min；加4%naoh溶液10 ml,摇匀,用甲醇定容至25 ml,放置15 min,在510 nm波长处测定吸收度,计算贯叶金丝桃总黄酮的含量。

　　2.2.3  供试品溶液的制备 

　　称取贯叶金丝桃粉末2.0 g,准确加入甲醇50.0 ml,超声40 min,过滤,蒸干,即得供试品溶液。

　　2.2.4  稳定性试验 

　　取样品溶液,分别在0、1、2、3、4 h取样1.0 ml,计算样品中贯叶金丝桃总黄酮含量,结果样品在4 h内稳定,rsd＝1.88%。

　　2.2.5  重复性试验 
　　
　　取贯叶金丝桃粉末2.0 g(共6份),按供试品制备方法及测定方法分别制备和测定,计算贯叶金丝桃总黄酮含量,结果rsd＝1.96%。

　　2.2.6  加样回收率试验 

　　精密称取已知贯叶金丝桃总黄酮含量的贯叶金丝桃粉末0.05 g(共6份),精密加入芦丁对照品适量,依法制备样品和测定,计算含量,结果见表2。表2  总黄酮加样回收率试验结果（略）
 
　　2.2.7  样品含量测定 

　　将供试品溶液比色,测定贯叶金丝桃提取物中总黄酮的含量,计算总黄酮的提取率。

　　3  正交试验

　　3.1  正交设计

    取100 g贯叶金丝桃(其中金丝桃苷含量为7.12 mg/g,总黄酮为48.58 mg/g)碎成粗粉,用乙醇加热回流提取,过滤,滤液减压回收乙醇至无醇味,加沸水1 000 ml溶解,冷却,过滤,浓缩,干燥,得到贯叶金丝桃提取物,并进行含量测定。以总黄酮的提取率和金丝桃苷的提取率为指标,采用正交设计对贯叶金丝桃总黄酮的提取工艺条件进行优选。根据文献和预试验结果,选择醇浓度(a)、溶媒用量(b)、提取时间(c)、提取次数(d)4个试验因素,每个因素3个水平,按l9(34)正交表进行试验,因素水平安排见表3。表3  贯叶金丝桃提取工艺因素水平表（略）

　　3.2  结果分析

    根据贯叶金丝桃提取工艺相关文献[1-4],以贯叶金丝桃总黄酮、金丝桃苷的提取率为指标,权重系数均为0.5,试验结果和方差分析见表4、表5。表4  正交试验结果（略）表5  方差分析表（略）注：f0.05(2,18)=3.55,f0.01(2,18)=6.01
   
　　结果表明,贯叶金丝桃采用乙醇回流提取,以总黄酮提取率、金丝桃苷提取率为检测指标时,提取溶媒、溶媒用量有显著影响,提取次数、提取时间没有显著影响。各因素对测定结果的影响次序为a＞b＞c＞d,优选工艺为a2b2c3d2,即用8倍量70%乙醇,提取3次,每次2 h。

　　3.3  验证试验
   
　　为进一步考察上述优选工艺的稳定性,按各种最佳条件,进行重复提取3次,每次100 g。100 g药材提取物,同上述处理方法、检测方法分析总黄酮和金丝桃苷,计算100 g药材中二者的提取量,结果见表6。证明优选的工艺条件为最佳工艺条件。表6  提取工艺验证试验结果（略）

　　4  讨论

    贯叶金丝桃为常用药材,其中总黄酮部分有明显的生物活性,其中金丝桃苷是其主要活性成分。因此,以贯叶金丝桃总黄酮及金丝桃苷为检测指标评价贯叶金丝桃提取工艺较为客观合理。总黄酮的分析方法较多[5-8],如紫外分光光度法、nano2比色法、hplc法等。由于贯叶金丝桃中含有多种黄酮类化合物,采用hplc需要多个对照品,含量测定比较繁琐；紫外分光光度法杂质干扰很大,所以,采用nano2比色法测定总黄酮的含量。采用hplc法测定金丝桃苷含量,质控方法简便可行,重复性和精密度均好,因此,该法可以作为贯叶金丝桃提取物中金丝桃苷含量的测定方法。
    　
　　正交试验法优选提取工艺结果表明,提取溶媒、溶媒用量、提取次数对总黄酮提取率有极显著影响,提取时间影响不大,理论的最佳提取工艺为70%乙醇,8倍量,提取3次,每次2 h。为考察最佳工艺的合理性,并进行了验证试验,结果表明优选的工艺条件合理、可行。

    提取液浓缩至无醇味后,若用水处理,笔者发现金丝桃苷和总黄酮损失很大,所以,在这一步操作过程中笔者采用沸水处理,总黄酮和金丝桃的损失较少。

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