作者：相淞华,宋建平,刘训红,张月婵
【摘要】 【目的】建立罗布麻叶挥发性成分顶空气相色谱—质谱（hsgcms）指纹图谱分析方法,评价不同产地罗布麻叶药材的质量。【方法】采用hsgcms联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析,测定其指纹图谱,确定共有指纹峰,并作模糊聚类分析和相似度评价。【结果】罗布麻叶挥发性成分中含有14个特征性指标成分,初步建立了以此14个共有峰为特征指纹信息的hsgcms指纹图谱。【结论】本方法准确可靠,重复性好,可作为罗布麻叶质量评价的依据。
【关键词】 罗布麻叶/化学；挥发性成分/分析；指纹图谱
罗布麻叶为《中国药典》收载的常用中药,系夹竹桃科植物罗布麻apocynum venetom l.的干燥叶,具有平肝安神、清热利水之功效［1］。现代用于治疗高血压、高血脂、冠心病、哮喘、气管炎等疾病有较好的效果［2］。罗布麻叶挥发性成分为主要活性成分之一,如芳樟醇有镇静、降血压、抗菌等作用［3］,薄荷酮和胡薄荷酮有解热、镇痛、抗炎作用［4］,藏红花醛有较强的抗癌活性［5］,氧化石竹烯有平喘、镇静、抗癌作用,1α萜品醇有显著平喘功效［6］,但尚未见有关罗布麻叶挥发油指纹图谱研究的报道。WWw.11665.Com本研究采用顶空气相色谱—质谱（hsgcms）联用技术对不同产地罗布麻叶的挥发性成分进行分析，现报道如下。
1仪器与试药
agilent 6890/5975b型气—质联用分析仪,g1701dad.03.00.611工作站,agilent g1888顶空自动进样器(美国安捷伦仪器公司),nist05标准质谱检索库。
罗布麻叶各产地样品为实地采集或由当地药材公司提供,编号为：s1江西,s2安徽,s3吉林,s4山东,s5山西,s6江苏,s7新疆,s8河北,s9内蒙古,s10天津,s11辽宁,s12陕西。均经研究者鉴定为夹竹桃科植物罗布麻apocynum venetom l.的叶。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。
2方法与结果
2.1分析条件
2.1.1色谱条件色谱柱：hp5ms(涂布浓度为5%的苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱,30.0 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度：180℃；程序升温：50℃保持20 min,以4℃/min的速率升至200℃,保持5 min；载气：he气,流量：1.0 ml/min,分流比15∶1。
2.1.2质谱条件电离方式：电子轰击离子源(ei)；离子源温度：230℃,四级杆温度：150℃,接口温度：280℃；电子倍增器电压：1 329.4 v；电子能量:70 ev；扫描范围：45.0~650.0 aum。
2.2顶空供试品制备
通过对药材粉碎粒度、体积装样量、顶空加热温度及顶空加热时间进行考察,确定罗布麻叶挥发性成分优化的顶空条件：取罗布麻叶粉末(过40目筛)3 g,精密称定,置顶空瓶中,密封,放入顶空进样器,120℃加热平衡30 min,供测试。
2.3方法学考察
2.3.12 h记录图取罗布麻叶挥发性成分进样分析,结果表明：60～120 min无出峰,提示50 min内挥发性成分出峰完全。
2.3.2精密度试验取罗布麻叶(s2)挥发性成分进行分析,连续进样5次。结果表明：14个指标成分群保留时间的相对标准偏差均小于0.21%,相对含量的相对标准偏差均小于5%,提示仪器精密度良好。
2.3.3稳定性试验取罗布麻叶(s2)挥发性成分进行分析,分别在1、3、6、24、48、120 h进样6次,得14个主要特征峰保留时间、相对含量。结果表明：14个指标成分群保留时间相对标准偏差均小于0.29%,相对含量的相对标准偏差均小于5%,提示120 h内样品(溶液)稳定性较好。
2.3.4重复性试验取同一批次罗布麻叶(s2)5份,提取挥发性成分后分别进样分析,得14个主要特征峰的保留时间和相对含量。结果表明：14个指标成分群保留时间的相对标准偏差为0%～1.37%,相对含量的相对标准偏差为1.83%～5.15%,说明重复性较好。
2.4指纹图谱建立
样品按选定的顶空条件及分析条件进行分析,测得所有供试品的气相色谱—质谱（gcms）总离子流图；再对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得质谱图,所有组分质谱数据经计算机处理和nist05标准质谱图库检索鉴定,并与有关标准谱图核对,初步确定出罗布麻叶挥发性成分中53种化合物。根据罗布麻叶挥发性成分hsgcms总离子流图所给出的峰数高、峰保留时间和峰面积值等相关参数以及成分鉴定结果,进行分析、比较,制定hsgcms指纹图谱(图1，见彩图页第666页)。
2.5指纹图谱分析
2.5.1共有指纹峰的标定经对挥发性成分gcms总离子流图的分析、比较,罗布麻叶标定14个共有峰作为指纹图谱的特征峰,1～14号峰化学成分依次为：2戊烯1醇、未鉴定、1,2,5,5四甲基1,3环戊二烯、3,5二甲基苯酚、安息香醛、2戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、β环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7a四氢4,4,7a三甲基(4h)苯呋喃酮。以2戊基呋喃(6号峰)为参照峰,分别求出各共有峰与之相比的α值(调整保留时间之比)和各共有峰的相对峰面积(峰面积之比)，见表1。表1罗布麻叶挥发性成分中共有峰的相对保留时间α值和相对峰面积（略）
2.5.2指纹图谱的聚类分析选择罗布麻叶挥发性成分中14个比较明显的共有峰,根据表1中的数据,采用spss 15.0软件中的hierarchical cluster analysis对12个罗布麻叶样品进行聚类分析,所用聚类方法为average linkage (between groups),距离公式为square euclidean distance,得不同样品罗布麻叶的聚类分析图。
图2结果显示：当距离标尺在1时,样品5、6、11,样品1、3、10,样品2、9各归为一类；当距离标尺在2时,样品5、6、11与样品4、8归为一类；当距离标尺在3时,样品4、5、6、8、11与样品1、3、10归为一类,样品2、9与样品7归为另一类；当距离标尺在8时,样品1、3、4、5、6、8、10、11与样品2、7、9归为一类；当距离标尺在25时,样品12才与样品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11即全部聚为一类。
2.5.3色谱峰的重叠率以罗布麻叶9号样品图谱为基准,按以下公式计算重叠率=［待测样品与标准样品共有的峰数×2/(待测样品与标准样品峰数和)］×100%。分别求得另外11种样品色谱峰的重叠率依次为：64.0%、82.5%、72.7%、79.5%、78.9%、75.7%、76.3%、67.6%、64.7%、74.6%、92%。
2.5.4相似度评价将测试数据导入excel表格,采用中位数夹角余弦法计算相似度,进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。各相似度值如下：s10.959、s20.925、s30.977、s40.986、s50.991、s60.957、s70.979、s80.963、s90.973、s100.987、s110.932、s120.888。结果显示，罗布麻叶样品指纹图谱相似度较好,均在0.88以上。
3讨论
挥发性成分顶空条件的优化：药材粉碎粒度的考察结果表明,60目药材粉末所得色谱峰峰数比40目、30目药材峰数明显减少,40目所得色谱峰数峰高较30目高,故粉碎粒度选择40目药材粉末。体积装样量的考察测定结果表明,1.5 g药材所测出的色谱峰数较少,2 g药材峰面积较小,3 g药材测出的色谱峰较多,峰面积较大,故体积装样量选择3 g。
顶空加热温度的考察测定结果表明,90℃和100℃加热温度下检出色谱峰的峰数明显减少,110℃和120℃加热检出的色谱峰中后者峰高较高,故样品加热温度选择120℃。顶空加热时间的考察测定结果表明,4个不同加热时间下的峰数相差不多,加热30 min的峰高较高,故样品加热平衡时间选择30 min。
不同产地罗布麻叶中均含有2戊烯1醇、未鉴定、1,2,5,5四甲基1,3环戊二烯、3,5二甲基苯酚、安息香醛、2戊基呋喃、顺式氧化芳樟醇、2,6二甲基环己醇、薄荷酮、藏红花醛、β环柠檬醛、胡薄荷酮、大马酮、5,6,7,7a四氢4,4,7a三甲基(4h)苯呋喃酮等14种主要成分,占挥发性总成分的60%左右,故以此14个特征性指标成分作为共有特征峰构建gcms指纹图谱。
应用模糊聚类法分析比较,能揭示挥发性成分中特征性成分质量分数的配比关系,更能全面、综合、准确地反映不同产地药材gcms指纹图谱的关系,本实验初步建立了罗布麻叶挥发性成分gcms指纹图谱分析方法,而且方法准确可靠，重复性好，为罗布麻药材的质量评价和gap实施提供了科学依据。
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