作者：邓瑞云，陈永刚，周改莲，区计明，林励，成陈波，李明
【摘要】 【目的】建立脑忆源胶囊中总黄酮和淫羊藿苷含量的测定方法。【方法】采用《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中规定的方法，以芦丁为对照品，采用紫外—可见分光光度法测定总黄酮含量，高效液相色谱（hplc）法测定胶囊中淫羊藿苷含量，色谱柱:luna cl8（2） 100r（150mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈—水（体积比为30∶70），流速：1.0ml/min，检测波长：270nm。【结果】芦丁在0～24.75μg /ml范围内呈良好的线性关系，r=0.9990，平均加样回收率为102.29％，sr为1.34％（n＝5）；淫羊藿苷含量在6.9×10-2～4.83×10-1μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系，r=0.9999，平均回收率为95.39％，sr为2.5%（n=5）。【结论】本研究所建立的方法能够准确测定脑忆源胶囊中黄酮类成分的含量。
【关键词】 脑忆源胶囊/化学；总黄酮/分析；淫羊藿苷/分析；色谱法，高压液相；分光光度法，紫外线
abstract：objectiveto establish a method for the determination of total flavonoids and icariine in naoyiyuan capsules. methodswith rutin as reference，total flavonoids was determined by ultravioletspectrophotometer with the method which was recorded in health food test and evaluation technological specification（2003 edition）. the content of icariine in naoyiyuan capsules was detected by hplc. the chromatographic separation was performed on luna c18（2） 100r column（150mm×4.6mm，5μm） with mobile phase consisted of acetonitrilewater（30∶70） at a flow rate of 1.0 ml/min．the detection wavelength was set at 270 nm. resultsrutin showed a good linear relationship at the range of 0～24.75μg/ml，r=0.9990，and the average recovery was 102.29% with rsd being 1.34%. icariine had good linearity in the concentration range of 6.9×10-2~4.83×10-1 μg，r=0.9999．the average recovery was 95.39％ with rsd being 2.5%（n=5）．conclusionthe method is simple and accurate，and it can be used for the determination of total flavonoids in naoyiyuan capsules．
key words:naoyiyuan capsules/chemistry；total flavonoids/analysis；icariine/analysis；chromatography，high pressure liquid；
脑忆源胶囊是由补肾中药巴戟天、淫羊藿为主，辅以枸杞子、山药组成的保健食品，用于辅助改善记忆、缓解体力疲劳等症状。wWW.11665.Com现代研究已证实该方中单味药材含有丰富的黄酮类和糖类物质［1］，具有增加脑血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，抗衰老等功效［2］，可用于改善记忆力、缓解体力疲劳及抗衰老等［3-4］。由于糖类物质无紫外吸收［5］，故本实验选择总黄酮和淫羊藿苷作为脑忆源胶囊的测定指标，建立其含量测定方法。现报道如下。
1仪器与试药
8453e型紫外可见分光光度计（美国 agilent公司），天美液相色谱仪（lc2030型紫外检测器、l2200型进样器、lc2130型泵），elo2116729型紫外分光光度计，bs110s电子天平（sartorius 公司）。脑忆源胶囊样品为自制（批号：20080624、20080819、20080916），芦丁对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：100080200306），淫羊藿苷对照品（购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：0737200111），聚酰胺粉（柱层析用，60~80目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂），乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，甲醇、乙醇、苯均为分析纯。
2方法与结果
2.1总黄酮的含量测定
2.1.1溶液的制备［6］
2.1.1.1芦丁对照品溶液的配制称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解制成50μg/ml的芦丁溶液。
2.1.1.2供试品溶液的制备取脑忆源胶囊3粒（批号：20080819，平均装量0.45g/粒），精密称取内容物粉末1.0g，加乙醇定容至25ml，摇匀后，超声（500w，40khz）提取20min；放置，吸取上清液1.0ml，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱；先用20ml苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，收集洗脱液约80ml，水浴浓缩，定容至25ml；此液于波长360nm处测定吸收值，代入回归方程，计算试样中总黄酮含量。
2.1.2标准曲线的制备吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm处比色。以对照品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y=0.027 3x-0.010 2，r=0.999 0，线性范围为0～24.75μg/ml。
2.1.3精密度试验取芦丁对照品溶液（14.85μg/ml），连续测定5次，结果其吸光度值的sr为0.46%，表明精密度良好。
2.1.4重复性试验精密称取供试品1.0g（批号:20080819），平行5份，制备供试品溶液，按2.1.2项下方法测定其吸光度值，结果其吸光度值的sr为 0.29%，表明该方法的重复性较好。
2.1.5稳定性试验取同一供试品溶液（批号:20080819），分别在0、15、30、45、60min时测其吸收度，结果其sr为0.05%，说明供试品溶液在60min内稳定。
2.1.6加样回收率试验精密称取已测含量的胶囊内容物（批号:20080819），加入芦丁对照品，按2.1.1.2项下制备方法进行试验，其平均回收率为102.29%，sr为1.34%，结果见表1。
表1加样回收率试验（略）
2.1.7供试品溶液的测定取3批脑忆源胶囊内容物1.0g，精密称定，按2.1.1.2项下方法进行试验，在360nm波长处测定吸光度值，代入回归方程计算，3批胶囊的总黄酮平均含量为11.44mg/g，结果见表2。表23批脑忆源胶囊中总黄酮含量测定（略）
2.2淫羊藿苷的含量测定
2.2.1溶液的制备［7］
2.2.1.1对照品溶液精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解制成34.5μg/ml的溶液。
2.2.1.2供试品溶液取胶囊内容物，精密称取0.1g（批号：20080819），置具塞锥形瓶中，加体积分数80％乙醇25ml，称定质量，超声处理30min，再称定质量，用体积分数80％乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.1.3阴性样品溶液取不含淫羊藿的阴性制剂样品，按2.1.2项下方法制备阴性样品溶液。
2.2.2检测波长的选择取按2.2.1项下方法制备的3种溶液，分别在200～600nm范围内进行波长扫描，结果显示对照品溶液和供试品溶液均在270nm处有最大吸收，阴性溶液在270nm处无吸收，结果见图1。
2.2.3色谱条件［8］色谱柱：luna cl8（2） 100r（150mm ×4.6mm，5μm），流动相：乙腈—水（体积比为30∶70），流速：1.0ml/min，检测波长：270nm。以淫羊藿苷计算理论塔板数不低于6000。
2.2.4专属性试验在上述色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液10μl进样测定，记录色谱图，淫羊藿苷峰保留时间为5.89min，阴性样品在淫羊藿苷峰位置无干扰峰，供试品中淫羊藿苷与其他组分分离完全，分离度为2.09，理论板数以淫羊藿苷峰计算为6057，结果见图2。
2.2.5标准曲线绘制精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、12、14μl ，按2.2.3项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，回归方程：y=132307x-10726，r=0.9999，结果表明淫羊藿苷在6.9×10-2～4.83×10-1μg呈良好的线性关系。
2.2.6精密度试验精密吸取对照品溶液10μl，连续进样5次，测定淫羊藿苷峰面积，结果峰面积积分值sr为0.95%（n=5），表明精密度良好。
2.2.7重复性试验取同一批号样品（批号：20080819）5份，按供试品溶液制备方法制备，进样10μl测定，淫羊藿苷含量均值为3.96mg/粒，sr为2.7%，表明重复性良好。
2.2.8稳定性试验取2.2.1.2项下供试品溶液分别于0、4、8h进样，测定淫羊藿苷峰面积，结果峰面积积分值sr为0.59%（n=3），表明供试品溶液在8h内稳定。
2.2.9加样回收试验精密称取5份已知含量的样品（批号：20080819）约0.05g，精密加入淫羊藿苷对照品溶液1ml（0.49mg/ml），按2.2.1.2项下方法制备供试品溶液，进样10μl测定，计算回收率，结果见表3。表3淫羊藿苷加样回收率试验（略）
2.2.10样品测定精密称取3批样品各0.1g，按2.2.1.2项下方法制备供试品溶液，进样10μl，依法测定淫羊藿苷的峰面积，照外标一点法计算含量，结果见表4。表4脑忆源胶囊中淫羊藿苷含量测定（略）
3讨论
目前改善记忆功能的国产保健食品中含中药或植物药组方者较少，仅舒脑口服液和脑轻松胶囊涉及，功效成分为总黄酮，但其制剂总黄酮标示含量均在100mg/kg以下。本试验测得脑忆源胶囊中总黄酮含量达11440mg/kg，淫羊藿苷含量达8520mg/kg。按剂量服用，每天总黄酮摄入量可达到60mg左右，为产品的药效学研究奠定了辅助改善记忆功能的物质基础。总黄酮的含量测定方法报道很多，目前收载入相关国家标准的有3种方法：文献［6］中收载的2种方法和药典［7］中收载的方法。有学者［1］比较了上述3种方法对总黄酮含量测定的影响，表明文献［6］中收载的“检验二法”最合理、简便，因此本实验选择该法测定总黄酮的含量。
淫羊藿苷测定预试验中， 对供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液分别进行紫外扫描，结果显示对照品和供试品均在270nm处有最大吸收，而阴性对照溶液在270nm处无吸收，因此选择270nm作为检测波长。以不同比例的乙腈—水为流动相进行测定，确定乙腈—水的体积比为30∶70，淫羊藿苷峰型良好，各组分分离效果好，阴性样品无干扰。
本研究所建立方法可准确测定脑忆源胶囊中黄酮类成分的含量。
【参考文献】
［1］陈永刚，刘晓涵，区计明，等.不同测定方法测定淫羊藿中总黄酮含量的比较［j］.食品科技，2009（5）：291.
［2］沈自尹.淫羊藿总黄酮延缓衰老的研究［j］.世界科学技术——中医药现代化，2005， 7 （1）：12.
［3］黄琳娟，林颖，田庚元，等.枸杞子中免疫活性成分的分离、纯化及物理化学性质的研究［j］. 药学学报，1998，33（7）：512.
［4］肖凤霞，林励.巴戟天补肾壮阳作用的初步研究［j］.食品与药品，2006，5 （8）：45.
［5］刘晓涵，陈永刚，林励，等.不同产地巴戟天中糖类成分hplcelsd指纹图谱研究［j］.中草药，2009，40（10）：1641.
［6］黄雨三.保健食品检验与评价技术规范实施手册［s］.北京：清华同方出版社，2003：1082，1242.
［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［m］．北京：化学工业出版社，2005：229．
［8］钟涧.高效液相色谱法测定龟鹿补肾胶囊中淫羊藿苷的含量［j］.广东药学院学报，2004，20（4）：625.
