作者：胡喜兰 程青芳 尹福军 李静
【摘要】 目的为适时采收，合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系。方法通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，利用hplc法测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，同时利用dpph·法测定其抗氧化活性并加以比较。结果发现不同树龄的银杏叶黄酮含量差异较大，不同生长季节含量存在着差异，春季含量高于秋季；银杏叶提取物的抗氧化活性与黄酮含量基本成正比关系。结论春季采收银杏叶有利于黄酮化合物的开发利用。
【关键词】 银杏叶； 黄酮； 提取； 测定
银杏叶是银杏科银杏属植物ginkgo biloba l.的叶子。我国自古以来就认为银杏叶的性味甘、苦、涩、平，归心、肺经。本草纲目中记载银杏具有“敛肺平喘，止遗尿、白带”的功效［1～3］。可用于治疗肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂等症［4,5］。其药用价值日益引起国际医药、化学和植物学界的重视，开始了对银杏叶的综合开发利用和研究。wWw.11665.COm为适时采收合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系，本文通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，探索hplc法的最佳色谱条件，测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，为进一步研究提供依据。
1 仪器与材料
紫外分光光度仪：日本岛津公司；b-220型恒温水浴锅：浙江舟山市定海区海源仪器厂；ks-150d型超声波清洗器：宁波科生仪器厂；shz-cd 型循环水式多用真空泵：浙江舟山市定海区海源仪器厂；wfz-2000型紫外可见分光光度计：尼龙柯仪器有限公司；shimadzu lc-l0a型高效液相色谱仪：日本岛津公司；bs210s 型电子天平（max=210g d=0.01mg）：北京塞多利斯天平有限公司；dhg-9240a型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；xa-1 型固体粉碎机：金坛市科兴仪器厂；sk-1快速混匀器：常州国华电器有限公司。
样品1： 4月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品2： 4月下旬采于花果山九龙桥百年银杏树；样品3： 4月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树；样品4：头年10月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品5：头年10月下旬采于连云港花果山九龙桥百年银杏树；样品6：头年10月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树。6种样品叶均于55℃恒温干燥后，粉碎过筛，置于磨口瓶中，密闭避光保存。
槲皮素、山萘酚标准品(中国药品生物制品鉴定所出品)异鼠李素标准品(biochemika公司)，dpph·（1,1-二苯-2-苦肼基 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，sigma 公司），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司出品）。甲醇、盐酸、磷酸、醋酸等均为分析纯试剂，水为去离子水(自制)。
2 方法
2.1 黄酮标准品溶液的制备
2.1.1 山萘酚标准储备液准确称取4.65 mg的山萘酚，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。
2.1.2 槲皮素标准储备液准确称取28.8 mg的槲皮素，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。
2.1.3 异鼠李素标准储备液准确称取5.00 mg的异鼠李素，加甲醇溶解，完全转移并定容至50.0 ml容量瓶中备用。
用时分别精密吸取一定量的上述储备液加甲醇稀释至一定刻度，摇匀即可。
2.2 样品溶液制备分别称取6种样品0.8 g，置于100 ml圆底烧瓶中，加入25 ml甲醇/25%盐酸（4∶1）混合液，闭塞称重，置于水浴中沸腾回流1 h，取出后冷却至室温，称重，以甲醇补足减失重量，过滤后转移至50 ml容量瓶，作为样品溶液1～6号。
2.3 标准溶液最大吸收波长测定分别将槲皮素、山萘酚和异鼠李素标准品及样品溶液用紫外分光光度仪在200～800 nm进行扫描，获得最大吸收波长并加以选择，以防止其他成分干扰。
2.4 最佳色谱条件测定通过对流动相中水和甲醇比值、流速及缓冲溶液的选择等多个方面的改变，获得将槲皮素、山萘酚和异鼠李素分离的最佳条件。
2.5 标准曲线的制作取标准品溶液，在最佳色谱条件下，分别进样2.5，5，10，15，20，30 μl，以峰面积（mv/min）为纵坐标y，以进样量（μg）为横坐标x，分别作槲皮素、山萘酚和异鼠李素线性回归曲线。
2.6 样品中槲皮素、山萘酚和异鼠李素含量测定和计算取“2.2”制备的样品液（1～6号）1 ml分别稀释于10 ml容量瓶中，在最佳色谱条件下，各进样15 μl，测样品中槲皮素、异鼠李素、山萘酚的峰面积a1，a2，a3，由3者的标准曲线及回归方程，采用外标法，获得进样黄酮量，按下式算出槲皮素、山萘酚和异鼠李素的含量。
c=（x/15×250）/m样品
式中：c-样品中黄酮的含量（mg/g）
x-进样溶液中黄酮的量（μg）
m样品-样品的质量（g）
2.7 总黄酮苷含量计算银杏叶中含有30多种黄酮类化合物，主要以糖苷形式存在，直接测定银杏黄酮苷的含量较困难，因为种类太多分离困难、对照品不易得。而这些苷中的苷元主要是槲皮素、山萘酚和异鼠李素，通过其苷元的含量再换算成总黄酮苷含量。槲皮素（quercetin）的分子量是302.2，山萘酚（kaempferol）和异鼠李素（isorhamnetin）的分子量分别是286.24和316.27。据报道，槲皮素鼠李糖-对羟基桂皮酰葡萄糖苷（分子量为756.7）是银杏对心血管系统的主要有效成分，所以被应用作为有效成分含量测定时计算的依据，即黄酮苷与苷元分子量比值取r=756.7/302.2=2.51。
总黄酮苷含量=（q+k+i）×2.51
q、k、i分别表示槲皮素、山萘酚和异鼠李素的黄酮含量。
2.8 重复性实验分别精密称取样品3粉末3份，在相同的条件下提取溶液，在选定的色谱条件下测定峰面积。
重复性越好说明实验的精密度越好，重复性一般用相对标准偏差（rsd）表示。将被测样品进样3次，根据得到峰面积计算相对标准偏差。
2.9 精密度实验精密吸取样品3稀释液15 μl，在最佳色谱条件下，连续进样3次，测得峰面积，计算其标准偏差和rsd值。
2.10 加样回收率实验分别准确移取已知含量的样品1～3号1 ml于3个10 ml容量瓶中，各加入槲皮素标准溶液（288 μg/ml）0.1 ml，混合均匀，按黄酮类化合物的分析方法进行检测，计算槲皮素的回收率。
3 结果
3.1 标准溶液最大吸收波长槲皮素、山萘酚、异鼠李素3种黄酮苷元和样品的uv 吸收曲线表明，其最大吸收波长虽略有差异，但在390 nm处均有较强的吸收，故选择390 nm为检测波长。
3.2 标准曲线在选定条件下，3种黄酮苷元的标准曲线测定结果见表1。表1 银杏黄酮苷元的线性回归曲线（略）
3.3 样品中黄酮含量测定结果见表2。表2 样品中黄酮含量
样品号样品质量（略）
由表2可知，槲皮素含量在样品1中最高，为0.459%；其次是样品4，为0.362%，这两个样品采于淮工数十年生银杏。千年生银杏叶与百年生银杏叶的含量相差不大；山萘酚含量在样品2中最高，为0.191%，其次是样品3，为0.134%，说明秋季样品山萘酚含量随树龄呈递减趋势；异鼠李素含量在样品3中最高，为0.240，其次是样品6，为0.194%。这两个样品均采于千年生银杏，说明异鼠李素含量随树龄呈递增趋势，春季样品各黄酮含量均明显高于同种秋季样品。
3.4 重复性实验结果见表3。表3 样品的重复性实验结果（略）
由表3可以看出槲皮素、山萘酚和异鼠李素的rsd较小，所以此次实验的重复性良好，精密度达到要求。
3.5 精密度实验结果见表4。表4 样品的精密度实验结果（略）
由上面3种成分的相对标准偏差可以看出，该方法精密度良好。
3.6 加样回收率实验结果见表5。表5 样品的加样回收率实验结果（略）
由表5可以看出槲皮素、山萘酚和异鼠李素的回收率都达到要求，因此验证了该方法的可靠性。
4 结论
本实验应用高效液相色谱法测定了连云港地区不同年代春秋两季的银杏叶黄酮组分,包括槲皮素、山萘酚和异鼠李素的含量。测得的数据表明，6种样品中春季采摘的银杏叶中黄酮含量明显高于秋季银杏叶。不同树龄银杏叶3种黄酮苷元的含量比例顺序发生变化：数十年银杏叶样品中以槲皮素含量居多，百年样中山萘酚较多，千年样中异鼠李素含量明显高于前两者。抗氧化活性测定结果与其黄酮含量测定结果基本一致，春季银杏叶明显高于秋季银杏叶（另文报道）。但同一产地银杏叶中，以千年银杏叶的抗氧化活性最高，说明抗氧化活性不仅与其黄酮含量有关，其他活性物质也有影响，进一步的研究还在进行。
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