【摘要】 目的探讨中药桂枝对mrl小鼠心肌细胞凋亡的作用及对caspase 3基因表达的影响。方法将mrl小鼠分为空白组、强的松组和桂枝组，检测mrl小鼠心肌组织凋亡细胞，计算心肌细胞凋亡指数（ai），ｒｔ-ｐｃｒ法检测心肌细胞凋亡基因caspase 3表达，观察桂枝对mrl小鼠心肌细胞凋亡的影响。结果桂枝能调控心肌细胞凋亡基因caspase 3表达，即抑制caspase 3表达，明显抑制心肌细胞凋亡(心肌细胞凋亡指数显著下降)。其疗效明显优于空白组（p<0.05），有显著性差异，与强的松组疗效相当（p>0.05）。结论桂枝可能通过调控凋亡基因而抑制心肌细胞凋亡，从而延缓或部分逆转mrl心肌损害的发生、发展。
【关键词】 mrl小鼠； 细胞凋亡； caspase 3基因表达
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,sle）是一种多因素参与的累及全身多脏器、多系统的自身免疫性疾病，现代医学多采用肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂、非甾体抗炎药等治疗，但有明显的副作用，停药后病情也易反复，治疗现状不容乐观。目前在中医中药领域内寻找治疗sle及sle心肌损害的有效药物，并从调控凋亡基因、抑制细胞凋亡切入研究其作用机理，是一项很有裨益的探索。本实验对mrl小鼠应用桂枝进行了该方面的探讨。
1 材料与仪器
1.1 动物
8～10周龄雌性mrl小鼠，体质量20～25 g，由上海动物中心提供。wWw.11665.COM
1.2 药品桂枝药物由河北工程大学附属教学中医院提供，强的松片由浙江仙居制药厂生产。
1.3 试剂rna提取试剂trizol reagent购自华美生物工程公司，为invitrogen公司产品；逆转录酶（amv-rt ），核糖核酸酶抑制剂（rnasin），dntp，taq dna聚合酶（taq dna polymerase），随机引物（random primers），琼脂糖（agarose）均购自美国promega 公司。
1.4 仪器756型紫外分光光度计为上海精密仪器厂生产；geneamp 9600型pcr仪 为美国pe公司生产；rs-28高速低温离心机为 德国贺利氏公司生产；超低温冰箱为德国贺利氏公司生产；uvp凝胶扫描系统由美国uvp 公司生产；微量移液器 为德国gilson公司生产；dyz-22a型双恒定时电泳仪为北京市六一仪器厂生产；dyy-ⅲ桥式电泳仪为北京市六一仪器厂生产。
2 方法
2.1 实验分组与给药36只雌性mrl小鼠，随机分为3组，即空白对照组，强的松组，桂枝组，各12只。空白对照组给予生理盐水灌胃1ml/d，强的松组给予强的松混悬液灌胃0.02 g·ml-1·d-1，桂枝组给予桂枝煎剂0.12 g·ml-1·d-1，分两次给予，各组灌胃3周后处死动物，取心室肌组织。
2.2 检测指标与方法
2.2.1 心肌细胞凋亡ladder电泳用碱裂解法提取心肌ｍｄａ,洗涤,ｔｅ过夜溶解。制备1 5%的琼脂糖凝胶，加入dna样品，以5v/cm的电压电泳1～2ｈ，紫外透射仪观察dna条带，成像、照片。
2.2.2 凋亡及相关基因检测迅速分离心脏,常规石蜡包埋，切片数张。心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(tdt酶)介导的带荧光的dutp缺口末端标记法(tunel)标记凋亡细胞核的3’末端。分离mrl小鼠心脏，使用200℃干烤的器械于手术台上留取100 mg心室肌组织，迅速将组织置于4℃depc水中洗去血液后，置冻存管中保存于液氮中，m-caspase 3基因按照相应的rt-pcr实验流程进行检测，引物序列依据文献报道设计，由上海生物工程公司合成，rt-pcr产物在1%琼脂糖凝胶（含goldview染料）上电泳，120v，25min，用uvp凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统（gel-pro analyzer version 3.0）分析结果。
2.3 图像分析用图像分析仪900倍放大凋亡和免疫组化切片，每张片随机取10个视野，测定阳性染色的平均吸光度与阳性细胞百分比，计算细胞凋亡指数(ai)。
2.4 统计方法所有数据用spss11.5软件处理。数据以±ｓ表示。多组间比较用方差分析,两两比较用ｑ检验,率检验用χ2分析。
3 结果
3.1 桂枝对mrl小鼠心肌组织dna凋亡ladder发生率的影响空白对照组mrl小鼠通过dna琼脂糖电泳可见凋亡ladder的发生率明显较其它组高。桂枝组和强的松组心肌细胞凋亡ladder的发生率明显下降，两组与空白对照组相比经χ2检验，ｐ<0 01，差异有显著性。见表1。表1 各组小鼠心肌细胞dna凋亡ladder发生率的比较（略）
3.2 桂枝对心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响空白对照组mrl小鼠凋亡指数和m-caspase 3基因表达较高，与之相比，桂枝组和强的松组的心肌细胞凋亡指数和caspase 3基因表达明显降低，（ｐ<0.01），差异有显著性。桂枝组和强的松组相比无显著性差异（ｐ>0.05）。见表2。表2 各组小鼠心肌细胞凋亡及caspase 3 mrna基因表达的比较(略)
4 讨论
狼疮性心脏病变是系统性红斑狼疮（sle）常累及的器官病变之一，约30%的sle患者有心血管表现，约10%的患者有心肌损害，严重者可发生心力衰竭导致死亡［1］。有研究表明sle心肌损害与细胞凋亡有密切关系［2］。本研究发现mrl小鼠心室肌细胞凋亡明显增加，凋亡指数增高，同时caspase 3 mrna 基因表达明显增高，说明mrl小鼠心肌细胞凋亡和caspase 3 mrna基因表达存在必然联系，本课题通过观察空白组及治疗组心肌细胞凋亡和caspase 3 mrna基因表达的变化，力求探讨桂枝对于mrl小鼠心肌细胞的作用及机理。
促凋亡因子caspase 3是半胧氨酸蛋白酶家族中最重要的成员之一，以无活性的酶原形式存在于细胞浆中，在凋亡信号的刺激下经蛋白酶水解作用切去原结构域，形成四聚体而活化，活化的caspase 3参与了一系列与凋亡有关的细胞变化过程，包括细胞内蛋白底物的降解，凋亡抑制剂的失活，染色质的聚集，促使凋亡小体形成等［3～5］。 caspase 3介导的细胞凋亡与sle密切相关。以往大量研究表明系统性红斑狼疮（sle）在线粒体途径介导的细胞凋亡中，死亡受体与配体交联后经过一系列的过程可最终导致caspase 3活化，引起凋亡的发生［2，6］。本试验中空白对照组、桂枝组mrl小鼠心肌细胞凋亡指数增高，同时caspase 3 mrna基因表达亦明显增高，说明mrl小鼠心肌细胞凋亡与caspase 3 mrna基因表达之间有必然联系。本研究结果表明桂枝组mrl小鼠心肌细胞凋亡指数明显低于空白对照组，而其caspase3 mrna的基因表达低于空白对照组，说明桂枝通过影响caspase 3 mrna基因表达，进而抑制mrl小鼠心肌细胞凋亡，从而降低了mrl小鼠的心肌细胞凋亡指数。桂枝对mrl小鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用。
桂枝，辛，甘，温，归心、肺、脾、膀胱经，用于治疗胸痹心痛首见于《金匮要略》，叶天士又创出辛味通络法，扩大了桂枝治疗心脏疾病的适应症和治法，《本经疏证》总结:“和营、通阳、利水、下气、行瘀、补中，为桂枝六大功效。”桂枝是辛味通络的要药，临床适用于气虚、阳虚、气滞、寒凝、血瘀、痰浊等证型心绞痛病人［7］。以往关于桂枝的临床和实验研究表明，桂枝中含有桂油和桂皮醛，具有扩张皮肤血管，解痉镇痛强心和降血脂的作用，在冠心病治疗中有着重要作用［8，9］。但以往研究没有涉及桂枝对狼疮小鼠心脏病变的影响，以及桂枝对狼疮小鼠心肌细胞凋亡及相关基因的研究探讨。
本实验结果表明桂枝可以明显抑制caspase 3 mrna基因表达，与强的松组相比差异无显著性（ｐ>0.05）。据此可以推测桂枝抑制心肌细胞caspase 3 mrna基因表达是其抑制心肌细胞凋亡，减轻sle心脏病变的分子免疫学机制之一。本试验桂枝对sle心脏病变的研究是对中药治疗sle及作用机理的初步探索，尚需进一步的实验印证和深入研究，以深化中医药在该领域的研究，推动其进一步应用和发展。
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