作者：林卡莉，陈同强，黄志华，李思思， 陈方
【摘要】 目的探讨香菇多糖对荷瘤s180鼠免疫细胞及生存率的影响。方法昆明小鼠70只，分为正常盐水对照组，肿瘤模型ⅰ、ⅱ组，香菇多糖实验ⅰ、ⅱ组，生存实验模型组，生存实验给药组。观察计算小鼠体重、瘤重、肿瘤指数及抑瘤率，脾重及脾指数，脾组织结构，体视学方法计量脾白髓相对面积百分比及单位面积中脾小体的个数，外周血白细胞分类计数，小鼠生存质量和生存天数等指标。结果①香菇多糖有显著的抑瘤作用，并可明显延长荷瘤鼠的生存时间。②香菇多糖使脾指数明显升高，使荷瘤鼠脾白髓相对面积及脾小体个数明显增加。③香菇多糖使末梢血中性幼稚细胞比例明显增加。结论香菇多糖能使荷瘤鼠免疫细胞数量增加，明显延长腹水型s180小鼠的生存期。
【关键词】 香菇多糖； s180； 生存率； 体视学； 白细胞分类计数
abstract：objectiveto investigate the effects of lentina on immunocyte and survival rate in s180 tumor-bearing mice. methods70 mice were divided into 7 groups: normal saline control group，tumor saline control ⅰgroup，tumor saline controlⅱ group， tumor lentinan ⅰgroup，tumor lentinanⅱgroup，survive model group and survive lentinan group. evaluation of the experimental result included the general condition of the mice, inhibitory rate of s180 tumor, survival, changes in body weight, tumor weight, tumor index, spleen weights,spleen index , relative areas of spleen white pulp,splenic nodule number and wbc counts. results1. lentina could inhibit the growth of s180 sarcoma and prolong life of tumor-bearing mice obviously.2. spleen indexes were greatly higher and relative areas of spleen white pulp and splenic nodule number were increased in tumor lentinan group than others. 3.immature neutrophil ratio in tumor lentinan group increased. conclusionlentina can stimulate immunocyte propagating and prolong life of tumor-bearing mice obviously.
key words：lentina; s180； survive ratio; stereology; peripheral leucocytes count
香菇多糖（lentinan,ltn）作为一种重要的生物调节剂，因其确定的抗瘤效应，毒副作用小，已广泛应用于肿瘤的免疫治疗［1］。WwW.11665.Com但香菇多糖对荷瘤者生存质量和生存率的影响，以及它对荷瘤者免疫器官组织结构的影响，则少见研究。本实验以小鼠s180移植性肿瘤为模型，通过对肿瘤指数、抑瘤率、脾指数，脾组织结构观察，体视学方法计量脾白髓相对面积百分比及单位面积中脾小体的个数，外周血白细胞分类计数，小鼠生存质量和生存天数的观察等各项指标的测定分析，观察了香菇多糖对荷瘤（s180）机体免疫功能的影响，探讨了香菇多糖对肿瘤的作用效果及其可能的作用机制，为香菇多糖的进一步开发和利用提供实验依据。
1 材料
小鼠s180细胞株（sarcoma180）由中国医学科学院医药研究所购进，本院科研中心传代培养。实验用56天龄昆明小鼠，由赣南医学院实验动物中心提供。注射用香菇多糖生产厂家：南京康海药业有限公司，批号：051107。olympus显微镜。spss14.0统计软件包。
2 方法
2.1 荷瘤s180鼠模型的建立取已接种7 d肿瘤生长良好的s180腹水型小鼠，抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1×107，制成肿瘤细胞悬液（活细胞率﹥95%）。在小鼠右前腋皮下注射0.2 ml s180细胞悬液，制成实体瘤模型。
2.2 动物分组及处理昆明小鼠70只，随机分为7组，雌雄各半，后两组用作生存率实验。第1组为正常盐水对照组，右前腋皮下注射0.2 ml生理盐水，7 d后处死；第2组为肿瘤模型ⅰ组，第3组为肿瘤模型ⅱ组，第4组为香菇多糖实验ⅰ组,第5组为香菇多糖实验ⅱ组，这4组于接种肿瘤后第2天始分别隔日腹腔注射生理盐水0.2 ml和香菇多糖0.2 ml(每只每次0.025 mg)，第2，4组腹腔注射3次，第3，5组腹腔注射7次，均于最后1次给药后第2日处死；第6，7组处理方法分别同第3，5组，但7次腹腔注射后不处死，继续按常规饲养，并每日观察记录一般情况。
2.3 取材小鼠2%戊巴比妥钠全身麻醉，称重后剪开颈部皮肤，注射器穿刺颈内静脉取血，分别置抗凝管中和作二张血涂片；开胸，从左心室灌注生理盐水，至右心房流出清亮液体后改用4%多聚甲醛溶液灌注固定，迅速剥离肿瘤并取脾，电子天平称重后记录。然后按每只小鼠的不同编号分别入4%多聚甲醛溶液中后固定。血涂片自然风干后，甲醇固定，瑞氏染液染色待检。
2.4 检测指标
2.4.1 生存质量和寿命延长率每日观察记录生存实验各组小鼠的一般情况和肿瘤生长情况。寿命延长率=(给药组平均生存时间－模型组平均生存时间)/ 模型组平均生存时间。
2.4.2 脾重及脾指数，肿瘤重、肿瘤指数及抑瘤率计算公式：脾指数（mg/g）= 脾体质量（mg）/小鼠体质量（g）；肿瘤指数（mg/g）= 肿瘤体质量（mg）/小鼠体质量（g）；抑瘤率(%)=(肿瘤模型组肿瘤平均体质量－给药组肿瘤平均体质量)/ 肿瘤模型组肿瘤平均体质量×100%。
2.4.3 脾白髓相对面积及脾单位面积中脾小体的个数所取各组脾脏固定24 h后，按常规脱水透明，低温石蜡包埋。作连续切片，片厚5 μm，隔10片取1片，每例取3片，he染色，用体视学方法计量脾实质中结构的变化情况。计量方法如下：用物镜校准片校定方网系统中小方格的边长d及面积d2，以目镜测微尺测参照系脾组织面积测点数ps，参照系被测结构脾白髓交点数pw，计数脾小体的个数n。分别按公式aw = pw/ps ×100% 和ns = n÷（ps × d2）计算脾白髓相对面积aw及单位面积中脾小体的个数ns。
2.4.4 外周血白细胞计数和分类按常规在olympus显微镜下用血细胞计数板对抗凝血做白细胞计数；每个样本2张血涂片，每张血涂片观察100个白细胞，根据美国临床实验室标准化委员会（national committee for clinical laboratory standards, nccls)推荐的标准区分淋巴细胞、中性幼雉细胞和中性分叶细胞，并做记录。
2.5 统计学处理实验数据
以±s表示，采用spss14.0统计软件包进行统计学分析。经正态性检验和方差齐性检验满足正态分布和方差齐同后作单因素方差分析，组间差异用snk方法检测。
3 结果
3.1 香菇多糖对各组小鼠生存天数的影响小鼠接种肿瘤细胞4天后开始出现可触及肿瘤。肿瘤模型组小鼠成瘤率100%。小鼠饮食减少，毛发杂乱无光泽，竖毛现象明显，活动也明显减少。香菇多糖给药组小鼠成瘤率90%，肿瘤生长缓慢，且明显比肿瘤模型组小鼠活泼，皮毛有光泽，竖毛现象不明显，生存期明显延长。模型组小鼠50%死于20 d以内，而给药组小鼠只有20%死于20 d以内。到实验结束时（接种肿瘤后120 d），仍有二只小鼠存活，从外观看健康活泼，似无异常。但其中一只在右腹下可触及绿豆大肿块（已维持20多天未见增长）。各组小鼠生存情况见表1和图1。表1 各组小鼠平均生存时间和寿命延长率 (略)
3.2 香菇多糖对肿瘤生长的影响香菇多糖有显著的抑瘤作用。结果见表2。表2 各组小鼠肿瘤生长情况 (略)
3.3 香菇多糖对荷瘤鼠脾脏组织结构的影响肿瘤模型组脾白髓相对面积与单位面积脾结构中脾小体个数均比正常对照组下降，但在应用香菇多糖后，有明显回升。香菇多糖实验组小鼠的脾脏指数比正常盐水对照组及肿瘤模型组均有明显上升。以上情况随用药时间延长，改善更为明显。结果见图2和表3。表3 各组小鼠脾脏组织结构比较 (略)
3.4 香菇多糖对荷瘤鼠外周血免疫细胞的影响荷瘤鼠外周血白细胞总数低于正常组，香菇多糖能逆转这种状况，并使末梢血中性幼稚细胞比例明显增加，其差异均有统计学意义(p<0.05)。结果见表4。表4 各组小鼠外周血细胞比较 (略)
4 讨论
香菇多糖虽无直接的抗瘤活性，但能通过激活不同的免疫反应而达到预防肿瘤生成和转移的抗瘤效应。可使肿瘤缩小，显著延长荷瘤鼠的寿命［2～4］。本实验结果显示，香菇多糖在体内对实验性s180实体瘤的生长具有较明显的抑制作用，用药一周时肿瘤指数由38.810下降为24.032。抑瘤率达到35.21%。随着用药时间的延长，抑瘤效果更为明显，用药2周时肿瘤指数由75.934下降为27.872。抑瘤率达到61.45%。且小鼠生存状况也较好。接种肿瘤后存活30 d以上的，模型组只有30%，而给药组有60%。到实验结束时（接种肿瘤后120 d），给药组仍有两只小鼠存活，寿命延长率为72.76%。这表明香菇多糖有很好的延长s180荷瘤鼠寿命的作用，且与其明显的抑瘤效应有关。
有研究表明，虽然香菇多糖以宿主介导的t淋巴细胞免疫为主，但在实验动物中发现也有促进b淋巴细胞增殖和合成igg的功能，并能减轻由于使用抗肿瘤药物治疗引致的细胞毒性反应［5,6］。本实验肿瘤模型组脾白髓面积及单位面积内脾小体个数明显降低。应用香菇多糖后，脾指数增加，脾白髓的抑制情况得到改善，且随时间的延长，效果愈为凸显。当用药两周后，较未用药组比较差异有统计学意义（p<0.05），生发中心也更为明显。这提示香菇多糖可能通过激活th细胞，促进b淋巴细胞 的成熟、分化增殖，加强机体的抗肿瘤效应。本实验中，香菇多糖实验组脾白髓相对面积虽比正常组下降，但无统计学意义；且其脾指数与正常组比较有明显上升（p<0.05），这表明实验组脾白髓绝对面积不一定小于正常组。最终结果还有待做进一步的研究。
熊继安等人［7］的研究表明，香菇多糖能增加血中淋巴细胞和大颗粒淋巴细胞的数量， 促进淋巴细胞的转化率，增加nk细胞及t淋巴细胞的活性。本实验中香菇多糖使中性幼稚细胞比例明显增加，其结果与上述报道相符。这一事实表明，香菇多糖可能使宿主骨髓造血功能增强，这一方面改善了宿主的免疫抑制状态，使荷瘤宿主充分调动自身的抗瘤机制，另一方面，将可使荷瘤宿主生存质量得到改善，有益于配合放化疗药物的应用，帮助患者维持相对较好的免疫功能来承受药物的治疗，起到更好的抗瘤效应。
上述实验结果提示，香菇多糖具有调节免疫，协助抗肿瘤，延长荷瘤小鼠生存期的作用：其一是能提高脾指数，改善荷瘤机体脾白髓受抑制状况，加强机体的抗肿瘤效应；其二是能改善骨髓造血机能，使外周血白细胞总数及中性幼稚细胞百分比增加，恢复和提高宿主免疫功能。
【参考文献】
［1］刘栋,钱建亚,卜敏.香菇多糖抗肿瘤作用研究现状［j］.中国食用菌,2002,22（2）:6.
［2］wasser sp.medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides［j］.appl microbiol biotechnol. 2002，60(3):258.
［3］maruyama s, sukekawa y, kaneko y,et al.anti tumor activities of lentinan and micellapist in tumor-bearing mic［j］.gan to kagaku ryoho，2006 ，33(12):1726.
［4］金亨燮, 崔仁花, 李承宪. 香菇多糖的化学结构与药理功效［j］. 延边大学农学学报，2004, 26 (2):113.
［5］wang g, lin w, zhao r, et al.effects of six polysaccharides extracted from plants on the immunological cells of mice［j］. wei sheng yan jiu，2008，37(5):577.
［6］chen t, li d, fu yl, et al. screening of qhf formula for effective ingredients from chinese herbs and its anti-hepatic cell cancer effect in combination with chemotherapy［j］.chin med j (engl)，2008，121(4):363.
［7］熊继安,卢宏达.香菇多糖注射液对反复呼吸道感染患者免疫功能的影响［j］.药物流行病学杂志，2000，9(3):126.
