【摘要】 目的研究加水量、煎煮时间、煎煮次数、浓缩条件等水煎工艺控制因素对附子毒效组分含量相关性的影响。方法以生附子和常用炮制品为对照，采用离子对分光光度度法与异羟肟酸铁法分别测定总生物碱（ta）、酯型生物碱（ea）组分含量，并以毒效因子［w= （ta ea）/ ta］为综合评价指标，研究工艺因素对毒效因子的影响。结果不同炮制品和生附子药材毒效因子差别较大；水煎过程中，煎煮条件对生品影响较大，黑顺片的毒效因子基本保持稳定为97%左右，白顺片为81%，煎煮时间和次数是主要影响因素。结论炮制品水煎过程毒效因子的相对稳定可能是附子汤剂发挥药效、安全使用的先决条件，毒效组分不同比例可能是附子不同炮制品发挥不同药效的物质基础。
【关键词】 附子；总生物碱；酯型生物碱
abstract：objectiveto research the effect on the aconite toxicodynamics component's content related to decoction process controlling factors such as water volume,boiling time, boiling numbers,concentrated decoction process.methodswith cralp（crude radix aconiti lateralis preparata）and common processed products as a control, ionpair spectrophotometry and acid dye colorimetry and hydroxamic acid iron spectrophotometry were used to determine the content of total alkaloids and ester alkaloids， and toxicodynamics factor ［w = (taea) / ta］ for the comprehensive evaluation index to study the process factors on the impact of toxicodynamics factor.resultsdifferent processed products and cralp showed obvious differences in toxicodynamics factor.in water decoction process, decocting conditions showed great impact on cralp,the toxicodynamics factor of bplra（black prepared lateral root of aconite） basically remained stable for about 97%, and wplra (white prepared lateral root of aconite) 81%.decocted time and times were the main factors. conclusion decoction toxicodynamics factor relative stability may exert a prerequisite for the effect and safe use；different proportions of toxicodynamics components may be material basis of different processed products.
key words： ralp(radix aconiti lateralis preparata) ；ta(total alkaloids) ； ea(ester alkaloids)
附子(radix aconiti lateralis preparata)来源于毛茛科乌头属植物乌头aconitum carmichaeli debx．的侧生子根及加工品，是四川道地药材之一。www.11665.COM自医圣张仲景首创生附子用于临床汤剂至今，是临床常用传统有毒中药，回阳救逆疗效卓著。临床实际应用过程中，水量、火候、时间等条件很难掌握完全一致，虽然现在许多医院和药房的代煎提高了汤剂工艺的稳定性，但其工艺参数缺乏科学实验依据。目前文献报道乌头总碱对附子提取物提取工艺进行质量控制研究 ［1～3］。乌头类总生物碱（ta）是其主要有效组分，是乌头类中药常见质量控制指标；乌头类双酯性生物碱（ea）是毒性组分，是乌头类中药主要毒性控制指标［4］。本研究尝试利用毒效组分含量控制临床汤剂工艺的影响因素，以毒效因子（w）［（taea）/ta×100%］为评价指标，对生附子及其常用炮制品的汤剂水煎工艺条件（加水量、煎煮时间、煎煮次数、浓缩条件）进行考察，为阐明附子临床汤剂中附子毒效成分的相关性和应用的合理性提供实验依据。
1 仪器与材料
分光光度计：perkinelmer lambda 35型；电子分析天平：sartorius系列十万分之一（德国）；phs2型酸度计(上海雷磁仪器厂)。对照品：乌头碱(110720200208，中国药品生物制品检定所)；乙醇、溴甲酚绿、氯仿、乙醚、氨水皆为分析纯。其他试剂自备。
生附子由成都中医药大学中药鉴定教研室严铸云副教授鉴定为乌头aconitum carmichaeli debx．的侧生子根及加工品。黑顺片，白附片为同批加工品，购于四川江油gap生产基地，质量均符合药典规定。
2 方法与结果
2.1 药材毒效因子的测定离子对溴甲酚绿法测定总生物碱是经典的生物碱测定方法，本研究参考文献［5］中的方法，酯型生物碱测定方法参考2005版《中国药典》［4］制川乌项下测定法测定。水提液样品的前处理略做修改，并进行了方法学考察，结果符合稳定性、精密度、加样回收率均达到定量要求。依前法测定药材ta和ea，并计算毒效因子，结果见图1。
结果表明，附子炮制后毒效成分比例变化有差异，黑顺片中毒性成分占总生物碱比例增大，白附片中毒性成分占总生物碱比例减少。提示不同炮制方法改变了毒效组分比例。
2.2 水煎过程控制研究
2.2.1 供试液的制备分别取生附子、黑顺片，白附片粗粉(1号筛)适量，精密称定，置圆底烧瓶中，加10倍量水，浸泡30 min，回流，快速烧开后，保持微沸2 h；趁热粗滤，用适量水洗涤残渣3次，合并洗液和滤液，3 000 r/min离心(5 min)，过滤，70℃下减压浓缩至1∶1体积；用氨水调ph=9～10，ta测定用乙醚一氯仿(3:1)的混合液、ea测定用乙醚萃取3次，置蒸发皿中水浴低温挥干溶剂，备用。
2.2.2 加水量的影响取3批药材适量各7份，分别加6，8，10，12倍量水，依“2.2.1”项方法制备，备用。依前法测定ta和ea，并计算毒效因子，结果见图2。
结果表明，水煎过程显著降低了各样品的毒性，提高了其毒效因子水平；其中黑顺片影响最大，白附片影响最小。不同加水量对炮制品毒效因子影响较小。提示水煎过程中毒效组分溶出水平有差异，加水量对其影响较小。
2.2.3 煎煮时间的影响取3批药材适量各7份，分别加水煎煮2，4，6，8，12 h，依“2.2.1”项方法制备，备用。依前法测定ta和ea，并计算毒效因子，结果见图3。
结果表明，煎煮时间对生、炮制品的毒效因子影响截然不同；其中对生附子影响较小，对炮制品而言，6 h后黑顺片和白附片毒效因子水平正好相反。提示控制煎煮时间可以改变不同炮制品的毒效因子水平。
2.2.4 煎煮次数的影响取3批药材适量各7份，分别加水煎煮3次a（20.50.5），b（211），c（222）依“2.2.1”项方法制备，备用。依前法测定ta和ea，并计算毒效因子，结果见图4。
结果表明，煎煮次数显著改变生、炮制品的毒效因子；其中生品影响最大。提示单煎有利于毒效组分的稳定。
2.2.5 浓缩条件的影响取3批药材适量各4份，浓缩分别采用60℃，70℃，80℃减压浓缩，100℃蒸发至1∶1，备用。依前法测定ta和ea，并计算毒效因子，结果见图5。
结果表明，浓缩条件对生附子毒效因子影响很大，对炮制品影响较小。提示炮制品毒效组分比较稳定，能耐热。
3 讨论
汤剂一直是中药临床应用的主要形式,中药汤剂的疗效已被历史实践所证实。目前汤剂的研究在中药配伍和方剂研究领域多有报道［6］，但在临床煎煮过程中，受客观条件和患者主观条件的影响，加水量、火候、时间等影响因素很难掌握完全一致，随意性很大。尤其是象附子类的有毒中药，煎煮用法与其毒、效有直接关系，常导致中毒事故的发生。2005版《中国药典》规定的加工品就有盐附子、黑顺片、白附片、炮附片等，而历史使用的炮制品种有七十多种，还有生品入药的。一般认为附子的总生物碱和酯型生物碱、双酯性生物碱由新乌头碱、乌头碱、次乌头碱3种主要的毒性生物碱组成，不同来源的含乌头类生物碱药材，3种成分含量差别甚大。附子生物碱组分被公认为有效组分，其毒性组分是乌头类双酯型生物碱。但很难从单一指标的量上证明某类成分或某一成分在发挥临床稳定的疗效。
现代研究已证明附子炮制解毒的原理是以乌头碱为代表乌头类双酯型生物碱主要通过水解成单酯型乌头生物碱和乌头原碱的方式达到解毒的目的［7］。结果表明，附子在炮制成黑顺片后毒效因子降低了20%，白附片提高了7%。可见不同方法炮制后毒效因子显著不同。文献表明，炮制后酯性生物碱含量显著下降［8］。这可以为毒效因子提高提供依据，但不能解释黑顺片的下降问题。
在煎煮过程中，总生物碱的溶出率在50%～80%间，酯型生物碱在1%50%间。实际上生物碱的水溶解度不仅受生物碱的组成及溶解性决定，在植物体内存在形式、炮制辅料、炮制过程对存在形式与组成的影响、水煎工艺因素等对其毒效成分含量变化均有较大影响。水解的进行既需要一定的溶出量，更需要水解的条件才能进行，水解的条件不同水解的方式不同，是酸性水解或碱水解，同时水的酸碱性、水温、时间、浓度、其他成分等均对其量有较大影响。文献也表明，酯型生物碱不仅存在水解，还存在酯交换反应［9］。而研究表明煎煮过程中，3种生熟附子的毒效因子维持在81%～97%的水平，炮制品间更接近些。预示炮制不是为拉开毒效因子的差距，而是为汤剂中毒效因子的稳定。
自指纹图谱技术应用于中药起来，中药成分间的比例关系是指纹图谱中最重要的化学计量关系之一［10］，也是合理评价多组分中药的一条有效途径。因此，本课题选用选用毒效组分相关指标研究中药临床应用的合理性更具有非常重要的实际意义。同时炮制品水煎过程中水环境和溶出成分对毒效组分的稳定发挥了更大的作用。这预示炮制和煎煮的过程不仅有利于减毒，更有利于药效成分的稳定。附子炮制品毒效因子的稳定可能是附子汤剂使用发挥稳定药效、安全使用的基石，毒效组分合理比例可能是附子发挥不同药效的基础。
实验中，我们在选用四川道地中药，选用了3批药材，炮制品为同批生附子加工而成，质量经检验符合药典标准。为规范水煎过程，实验中采用了电热水浴回流提取工艺，对火力和水沸程度采用温度和时间相结合的控制方式，尽量减少实验的系统误差，提高汤剂研究的规范性，提高汤剂的量化水平。临床汤剂应用是中医临床用药的主要形式，我们研究团队在国家自然科学基金重大项目的大力支持下，开展了大量相关的基础性研究工作，坚持中药“性效用”相结合的原则 ［11］，研究中药的物质基础必须紧紧抓出中医临床运用这个主线，尤其是许多中药成分如生物碱、苷类、挥发油等成分在产地采收、加工、炮制、临床应用、制剂过程中可能发生结构上的变化，从而带来功效的根本性的变化。要求医生和药师在临床应用毒性中药时应重视煎煮条件对药效的影响，科研工作应坚持“从临床中来，到临床中去”的宗旨，加强中药临床用法对药效的基础研究，推动中医临床的科学化进程。
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