作者：王艳红，汪洪 ，徐磊，杨信东

【摘要】  目的对温莪术不同部位内生真菌进分离和分类鉴定。方法采用内生菌常规分离法对健康温莪术根、茎和叶的内生真菌进行了分离和鉴定。结果从温莪术中分离得到了99株内生真菌，经鉴定为21属，其中根部42株涉及11属，茎部12株涉及4属，叶部45株涉及12属。结论温莪术的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存在差异。

【关键词】  内生真菌； 分离； 鉴定； 温莪术

　isolation and identification of endophytic fungi from curcuma aromatica salisb

　　abstract：objectiveto isolate and identify the endophytic fungi of different positions in curcuma aromatica salisb.methodsendophytic fungi were isolated from healthy roots,stems and leaves of curcuma aromatical salisb and identified with conventional method.resultsninty-nine strains of endophytic fungi belong to 21 genus were isolated and morhpologically identified from curcuma aromatica salisb.forty-two strains of 11 genera were isolated in roots,12strains of 4 genera in stems,and 45 strains of 12 genera in leaves.conclusionthe quantity,population and distribution of the endophytic fungi are various in different position of curcuma aromatica salisb.

　　key words： endophytic fungi；  isolation；  identification；  curcuma aromatica salisb
   
　　植物内生真菌(endophytic fungi)是存在于健康植物组织、器官内，并不引起明显病害症状的一类真菌［1］ 。www.11665.Com植物与真菌的共生现象在生物进化过程中历史悠久而又极其普遍。虽然人们很早就知道内生真菌的存在，但直到1977年才对其重要性有所认识［2］。通过二十多年的研究，人们发现，作为地球上一类古老而又普遍的共生生物，植物内生真菌不仅可以提供人类丰富的药用性次生代谢产物［3］，而且有可能从整体上参与和协调植物与环境因子(包括病原微生物)的互作过程，从而对植物的抗逆性和环境适应性产生积极的影响［4］。
   
　　温莪术为姜科植物温郁金curcuma wenyujin y. h.chen et c. ling 的干燥根茎,其味辛、苦,性温。具有行气破血、消积止痛的作用［5］。含有莪术油、姜黄素、多糖、木脂素类、脂肪酸类及微量元素等多种不同生物活性的化学成分［6］。现代药理研究表明, 温莪术具有抗肿瘤、抗血栓、抗菌、抗病毒等作用, 对呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、循环系统疾病和皮肤溃疡都有较好的疗效［7］。由此，人们对它的关注也由来已久。但至今对温莪术内生真菌的研究报道还很少，如果能在温莪术内生真菌中能够发现类似的活性物质，无疑找到了一种可替代温莪术植物的新型生物资源，为此本实验对温莪术内生真菌进行了系统的研究。现将温莪术内生真菌的分离鉴定结果及种群分布报道如下。

　　1  材料

　　1.1  材 料

　　分离所用植物材料为温莪术根、茎、叶，采自温州医学院莪术种植基地不同生长时期的温莪术，无病虫害。

　　1.2 培养基内生真菌分离培养基为pda培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 ml )和wa—抗生素培养基(琼脂20 g，氨苄青霉素200 mg，链霉素200 mg，水1 000 ml )；纯化鉴定培养基为pda培养基和查氏培养基（蔗糖30 g，nano3 2 g，kcl 0.5 g，mgso4·7h2o 0.5 g，feso4 0.01 g，k2hpo4 1 g，琼脂15～20 g，水1 000 ml）。

　　2  方法

　　2.1  内生真菌的分离取温莪术的根、茎、叶，用刀切成2～3 cm的小块，按下列步骤进行表面消毒：自来水冲洗干净，75%的酒精漂洗1～2 min，无菌水冲洗3 min，0.1%的升汞漂洗10～20 s，无菌水冲洗4～5次。上述处理过的样品，在无菌状态下切割成约0.5 cm×0.5 cm 的小块(片), 分别置于已倒好的wa—抗生素平板培养基和pda平板培养基上，放置在28℃条件下。

　　2.2  内生真菌的纯化接种物培养3～7 d后，观察皿中材料切口处长出菌丝(菌落)，挑取切口处菌丝尖端转接到新的pda平板上，待长成菌落后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘的菌丝进行分离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝顶端纯化法如此反复纯化后，转入pda斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7 d后，对菌株进行编号，并放入4℃冰箱保存。

　　2.3  菌种的鉴定采用直接挑取制片法和插片培养法，观测菌种在培养过程中菌丝、个体发育、产孢结构和孢子形态等特征，对分离得到的内生真菌进行显微形态观察、分类鉴定［8～11］。

　　3  结果

　　3.1  分离方法的比较本实验过程中尝试了组织研磨涂平板和组织切片分离两种方法。结果表明研磨法的优点是能获得较多菌株，但表面消毒验证效果不佳，且菌株不易纯化；而组织切片培养的方法操作简单，表面消毒验证效果可靠，菌株易纯化。为此本研究最终选择了表面消毒后组织分离培养的方法。

　　3.2  温莪术内生真菌的分离及分类鉴定结果从温莪术根、茎、叶组织分离中,共获得内生真菌99株。结果见表1。 表1  温莪术内生真菌的分离鉴定结果（略）

　　从表1可看出，植物组织的部位不同,分离获得的内生真菌种类不同。从分布上来看，99株内生真菌中，根部分布42株内生真菌，占总菌株数的42%，11个属，占21个属的52%；茎部分布12株0内生真菌，占总菌株数的12%，4个属，占21个属的19%；叶部分布45株内生真菌，占总菌株数的45%，12个属，占21个属的57%。由此可见，温莪术内生真菌主要存在于植株的根和叶中，茎部相对较少。

　　3.3  温莪术内生真菌的种群组成 从温莪术不同组织中分离得到的99株内生真菌，经显微形态观察，初步鉴定为5目、6科、21属，另外，还有9株不产孢，为无孢菌群（见表2）。表2  温莪术内生真菌的种群组成（略）

　　由表2可知，温莪术内生真菌以镰孢霉属为优势种群，约占总数的13%；其次为曲霉属和青霉属，约占总数的10%；此外，无孢菌群在其内生真菌中也占有较大的比例。从表中可见温莪术内生真菌最明显的特征是在种类组成上具有多样性。

　　4  讨论
   
　　在内生菌的分离过程中，进行表面消毒时, 0.1%升汞的漂洗时间不能长,尤其是对于幼嫩的叶片消毒时间要比根茎更短,否则分离到的菌落少,甚至会把内生菌全部杀死。
   
　　所分离的真菌在查氏培养基上一般生长较缓慢,在马铃薯葡萄糖培养基(pda)上生长较快,许多真菌在pda上有色素产生,而在查氏培养基上无色素产生。pda营养比较齐全,所以培养效果好,生长快,这主要是营养条件决定的,因此，我们培养真菌一般用营养条件好的pda,而在鉴定时一般用查氏培养基,因查氏培养基成分清楚,干扰小,在其上生长时真菌的各种鉴定的特性更易显现出来。
   
　　从温莪术根、根状茎、茎、叶等部位分离到99株内生真菌,说明该植物体内伴生微生物的多样性比较丰富,植物内生真菌一方面表现出能与植物相互协调生活与植物形成共生关系,另一方面有些真菌也为植物病原菌,平时不引起植物发病,但它们对于无病症寄主而言仍存在一定威胁性,不同的微生物能相互作用,并建立一种平衡,在植物体内形成一种相对稳定的真菌菌群,其中一些是分离频率高,数量大的优势菌种,而另一些属于稀有菌种。
   
　　通过对温莪术不同部位的内生真菌的分离,发现植物组织和部位不同,分离获得的内生真菌种类不同。温莪术不同组织分离内生真菌的频率顺序为叶片>根>茎,说明内生真菌在温莪术不同部位的分布不同。研究结果表明,对于分离率较高的镰孢霉属和曲霉属在根茎叶中都能够分离出，显示它们能够系统性分布于宿主中，而顶毛单胞霉属和星刺壳孢属仅分布在茎部，其余各属均分布在根和叶部。这一结果表明一些内生真菌可能具有一定的组织专一性。
   
　　植物内生真菌和其宿主之间存在复杂的生物化学相互作用,植物形成的某些次生代谢产物可能就是内生真菌转化宿主组织中的前体物质所形成,本研究为进一步探讨植物与内生真菌的相互关系提供了重要的资料。

【参考文献】
  　［1］尹建雯，陈有为 ，李治滢，等.芦荟植物内生真菌的研究ⅱ．抗菌活性初探［j］.微生物学杂志，2004，24(2)：30.

　　［2］陈晖奇，徐焰平，谢丽华,等.茶树内生真菌的分离及其在寄主组织中的分布特征［j］.莱阳农学院学报(自然科学版)，2006，23 ( 4 )：250.

　　［3］邹文欣，谭仁祥.植物内生真菌研究新进展［j］.植物学报，2001，43(9)：881.

　　［4］rodriguez rj , redman rs and henson jm．the role of fungal symbioses in the adaptation of plants to high stress environments［j］.mitigation and adaptation strategies for global change，2004，9：261．

　　［5］国家药典委员会．中国药典,ⅰ部［s］.北京:化学工业出版社，2005：194.

　　［6］胡润淮,邵清松.温郁金化学成分研究进展［j］.时珍国医国药，2007，18（7）：1773.

　　［7］李国栋，许 付，沈爱军.莪术油的研究进展［j］.中国药学杂志，2002，37 (11)：806．

　　［8］中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组．常见与常用真菌［m］.北京：科学出版社，1978：31.

　　［9］魏景超.真菌鉴定手册［m］.上海：上海科学技术出版社．1979：534.

　　［10］邵力平，沈瑞祥，张素轩，等．真菌分类学［m］.北京：中国林业出版社，1983：297.

　　［11］张纪忠.微生物分类学［m］.上海：复旦大学出版社，1996：245.