作者：高宝安， 陈世雄， 邓红艳， 杨俊，黄骥
【摘要】 目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌a549/ddp细胞株的耐药逆转作用及对多药耐药相关蛋白（mrp）表达的影响。方法mtt法测定白花蛇舌草乙醇提取物对a549/ddp细胞耐药的逆转作用；半定量rt-pcr和western blot分别检测肿瘤细胞mrp mrna和蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物使a549/ddp细胞对ddp的耐药倍数由10.294下降至5.586；并显著降低a549/ddp mrp mrna和蛋白的表达。结论白花蛇舌草乙醇提取物可以部分逆转肺腺癌a549/ddp细胞对ddp的耐药；其逆转作用可能通过降低细胞mrp的表达来实现。
【关键词】 白花蛇舌草乙醇提取物； 人肺腺癌a549/ddp细胞； 多药耐药相关蛋白
支气管肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，早期多无症状，不少患者就诊时已经失去了手术治疗时机，因此治疗多采用化疗为主的综合治疗。铂类药物具有广泛的抗瘤谱，是肺癌化疗方案的一线药物，但随着晚期肺癌患者化疗的开展，铂类药物的获得性耐药问题日益严重，影响了化疗的效果。白花蛇舌草（hedyotis diffusa or oldenlandia diffusa）为茜草科耳草属植物，中医以全草入药，性寒，味甘淡，归心、肺、肝、大肠经，清热解毒，利尿，主治恶疮肿毒，泻痢等症，临床常用于治疗各类癌症［1］。WWw.11665.COm我们前期研究表明［2］，白花蛇舌草乙醇提取物通过促进肺癌a549细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。为了进一步阐明白花蛇舌草抗肿瘤的作用机制，为其应用于肿瘤临床提供实验依据，我们观察了白花蛇舌草乙醇提取物在体外对人肺癌耐药细胞株a549/ddp的耐药逆转作用和对多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，mrp）mrna和蛋白表达的影响。
1 材料
白花蛇舌草购于湖北省药材公司。取白花蛇舌草全草50 g，粉碎研磨，95%乙醇搅拌浸泡15 d，滤去残渣，水浴至液体全部蒸发干，而后加入ddh2o 50 ml溶解，得到生药浓度为1 g/ml，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存，用前用dmem培养基稀释至所需浓度。四甲基氮唑蓝（mtt），二甲基亚砜（dmso），胰酶均为美国sigma公司产品；顺铂（ddp）为山东齐鲁医药公司产品；rpmi1640培养基和dmem培养基为gibco公司产品；鼠抗人mrp及β-actin单抗购自美国santa cruz公司；胎牛血清为杭州四季清生物工程材料公司产品；其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 细胞及其培养肺腺癌细胞株a549购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，肺腺癌耐药细胞株a549/ddp由第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所陆俊羽教授惠赠，肿瘤细胞用含10％小牛血清的dmem培养基，在含5％co2，37℃饱和湿度的培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。为保持a549/ddp的耐药性，该细胞培养液含6 mmol/l的ddp，实验前2天更换为无ddp的dmem培养液。实验用细胞均处于对数生长期。
2.2 对肺癌a549/ddp耐药细胞的耐药逆转作用a549和a549/ddp两株细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1×105 ml-1，接种于96孔板，每孔100 μl。分设a549组、a549空白组、a549/ddp组、a549/ddp空白组和白花蛇舌草组，白花蛇舌草组为a549/ddp细胞加入终浓度为40 mg/ml白花蛇舌草乙醇提取物。细胞培养24 h后，分别加入终浓度为10，20，40，80，100，200 μmol/l的ddp，终体积为200 ml，每个浓度设6复孔，a549空白组和a549/ddp空白组则加入等体积的dmem，继续培养72 h后，每孔加入5 g/l mtt 10 ml，继续孵育4h，每孔加入200 ml二甲基亚砜（dmso）终止，振荡15 min，450型elisa-reader酶标仪（bio-rad公司）570 nm主波长，630 nm副波长检测吸光度。以空白对照组细胞活力为100％，按公式计算不同浓度ddp对a549、a549/ddp和加入白花蛇舌草的a549/ddp细胞增殖的抑制率。公式：细胞抑制率（%）＝(1－实验组吸光度/空白组吸光度)×100％。采用直线回归法计算ddp的半数抑制浓度ic50值。耐药倍数计算公式：耐药倍数＝耐药株ic50值/敏感株ic50值。
2.3 对肺癌a549/ddp耐药细胞mrp mrna和蛋白质表达的影响
2.3.1 半定量rt-pcr检测mrp mrnatrizol裂解培养的a549和a549/ddp细胞（ddp浓度为100 μmol/l），氯仿抽提，异戊醇沉淀，乙醇洗涤干燥获取总rna，逆转录成cdna，pcr扩增出mrp、内参β-actin基因片段。mrp引物序列参照文献［3］（上海博亚生物公司合成）：上游5'-gta cat taa cat gat ctg gtc-3'，下游5'-cgt tca tca gct tga tcc gat- 3'，扩增片段长度256 bp。反应条件：预变性94℃5 min进入循环，94℃变性30s，54.5℃退火30 s，72℃延伸60 s，共38个循环，最后72℃延伸5 min。内参β-actin基因引物序列（上海博亚生物公司合成）：上游5'-cac acg cag ctc att g -3'，下游5'-aag gac tcc tac gtt g -3'，扩增片段长度141 bp。反应条件：预变性94℃ 2 min进入循环，94℃变性30 s，54.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。反应完成后取5μl il-5 pcr产物，3 μl β-actin pcr产物及2 μl 5×上样缓冲液，加少量溴乙锭（eb）染色，行2%琼脂糖凝胶电泳。于紫外透射仪上观察电泳结果。用图像分析系统分别测每个目的基因及看家基因β-actin的吸光度（a）值，取目的基因与β-actin的a值比值即相对a值。
2.3.2 蛋白免疫印迹试验（western blot）检测mrp收集ddp浓度为100 μmol/l的肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上放置15 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，以bradford法作蛋白质定量后置－80℃贮存备用。灌制10％sds-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1∶500），4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，ecl显色。图像经uvp grabit image软件测定各条带的吸光度，以各条带的吸光度值与β-actin吸光度值的比值进行细胞间蛋白表达量的比较。
2.4 统计学分析所有数据均用±s表示，使用统计软件spss13.0进行t检验分析。
3 结果
3.1 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌a549/ddp耐药细胞的耐药逆转作用mtt结果见表1，ddp对a549和a549/ddp细胞的抑制作用呈浓度依赖性。ddp对a549细胞的ic50为27.90 μmol/l，对a549/ddp细胞的ic50为287.19 μmol/l，a549/ddp的耐药倍数为10.294。而经过白花蛇舌草乙醇提取物（40 mg/ml）作用后的a549/ddp细胞ddp的ic50为155.85 μmol/l，耐药倍数为5.586。表1 不同浓度ddp作用72 h对a549和a549/ddp细胞的抑制作用（略）
3.2 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌a549/ddp耐药细胞mrp mrna表达的影响a549/ddp细胞的mrp mrna的表达（a值为1.025±0.133）显著高于a549细胞（a值为0.106±0.018）（p﹤0.01）；而白花蛇舌草乙醇提取物则使a549/ddp细胞mrp mrna的表达明显减少（a值为0.537±0.062）（p﹤0.01），但仍高于a549细胞mrp mrna的表达（p﹤0.01），如图1所示。
3.3 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌a549/ddp耐药细胞mrp 蛋白表达的影响western blot检测显示，a549/ddp细胞的mrp蛋白表达显著高于a549细胞的表达；白花蛇舌草乙醇提取物能够减少a549/ddp细胞mrp蛋白的表达。结果见图2。
4 讨论
肺癌化疗疗效的降低，主要是肺癌细胞对化疗药物产生耐药性所致，因此积极寻找有效的肺癌化疗耐药逆转的有效方法是肺癌治疗的研究热点。研究表明［4，5］，多种中药如鸦胆子油乳、苦参碱、姜黄素等具有不同程度逆转肿瘤多药耐药的作用。白花蛇舌草是临床广泛使用的抗肿瘤中药之一，现代研究表明［6～8］，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。我们研究结果显示，a549/ddp细胞对ddp的耐药倍数为10.294，白花蛇舌草乙醇提取物（40 mg/ml）能够明显降低a549/ddp细胞对ddp的耐药性（耐药倍数由10.294下降至5.586），增敏倍数高达1.843倍。
肺癌细胞的多药耐药与p-糖蛋白（p-gp）、多药耐药相关蛋白（mrp）、肺耐药相关蛋白（lrp）、谷胱甘肽s转移酶、拓扑异构酶、细胞膜离子通道等多种因素相关，其中mrp在肺癌细胞表达的增强是重要的耐药机制之一。mrp的主要作用是在消耗atp的基础上将细胞内的阳离子或细胞毒性物质逆浓度梯度转运出细胞，降低细胞核内的药物浓度，使药物对dna靶点的绝对浓度降低，并可改变胞浆和细胞器的ph值及通过囊泡转运和胞吐作用将药物排出细胞，使药物到达其作用部位的浓度减少、药物活性成分脱离其作用部位和胞内药物浓度降低，从而使细胞产生耐药性［9，10］。我们研究结果表明，白花蛇舌草乙醇提取物能够明显抑制肺癌a549/ddp耐药细胞mrp mrna和蛋白的表达，从而增加肺癌细胞内ddp的浓度和分布，进而发挥对肺癌a549/ddp细胞的耐药逆转作用。
综上所述，白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌a549/ddp细胞株具有耐药逆转作用，其逆转作用可能通过减低膜表面转运蛋白mrp的表达来实现，其具体机制有待进一步的研究。
【参考文献】
［1］宋立人. 中华本草，第1版［m］. 上海：上海科学技术出版社，1999：433.
［2］高宝安，陈世雄，杨 俊，等. 白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌a549细胞株增殖和凋亡的影响［j］. 时珍国医国药，2009，20（6）：1392.
［3］冯觉平，孔庆志，黄 涛，等. 三氧化二砷对肺腺癌耐药细胞a549 /r 耐药性的影响［j］. 中华实验外科杂志，2006，23 (2) : 201.
［4］汤涛，蒙凌华，陈陵际，等. 鸦胆子油乳具有多药耐药逆转和拓扑异构酶ⅱ抑制作用［j］.中国药理学通报，2001，17（5）：534.
［5］陈旭昕，张 艰，赵 峰，等. 姜黄素对人肺腺癌a549/ddp细胞增殖活性的影响［j］. 第四军医大学学报，2007，28（24）：2287.
［6］lin cc, ng lt, yang jj, et al. antioxidant activity of extracts of peh-hue-juwa-chi-cao in a cell free system［j］. am j chin med. 2004, 32(3): 339.
［7］gupta s, zhang d, yi j, et al. anticancer activities of oldenlandia diffusa［j］.j herb pharmacother. 2004, 4(1): 21.
［8］单保恩，张金艳，杜肖娜，等. 白花蛇舌草的免疫调节活性和抗肿瘤活性［j］.中国中西医结合杂志，2001，21（5）：370.
［9］zhou sf, wang ll, di ym, et al. substrates and inhibitors of human multidrug resistance associated proteins and the implications in drug development ［j］.curr med chem, 2008, 15(20): 1981.
［10］toyoda y, hagiya y, adachi t, et al. mrp class of human atp binding cassette (abc) transporters: historical background and new research directions［j］. xenobiotica, 2008, 38(7-8): 833.
