【摘要】  目的研究艾里莫芬烷倍半萜抗白血病作用构效关系，为该类倍半萜结构修饰和开发利用提供参考依据。方法对呋喃艾里莫芬烷倍半萜-橐吾酮（ligularone，9）进行结构修饰，采用mtt法对从橐吾属植物中分离得到的艾里莫芬烷倍半萜以及橐吾酮结构修饰物进行体外抑制人早幼粒白血病细胞（hl-60）生长活性评价。结果以橐吾酮为原料通过光敏氧化得内酯倍半萜（10），鉴定为6-oxo-8β-methoxyeremophilenolide，通过还原和乙酰化反应获得了2个呋喃倍半萜修饰产物，分别为epiligularol(11)，epiligularol acetate(12)。活性评价实验结果表明所有内酯艾里莫芬烷倍半萜对hl-60细胞生长有明显的抑制作用，化合物1～6的ic50＜10μg/ml，化合物7，8，10的ic50在10～20μg/ml之间，具有c9和c10位不饱和结构的内酯倍半萜（1～6）活性较强；所有呋喃艾里莫芬烷倍半萜没有抑制活性，而橐吾酮通过光敏氧化转化为内酯倍半萜后有抑制活性。结论首次研究了橐吾酮的光敏氧化反应，橐吾酮的呋喃环光敏氧化后可转化为内酯环；首次探讨了艾里莫芬烷倍半萜抗白血病作用构效关系。该类倍半萜的12（8）内酯环可能是抗白血病（hl-60）的关键活性基团，具有c9和c10位不饱和结构的内酯倍半萜活性较强。

【关键词】  艾里莫芬烷倍半萜； 抗肿瘤； 构效关系； 白血病

　　abstract：objectiveto study the structure-activity relationship of eremophilane sesquiterpenes against leukemia. methodsthree derivatives(10-12) were prepared from ligularone. the in vitro cytotoxicities of nine eremophilane sesquiterpenes(1-9) which were isolated from ligularia species and three derivatives(10-12) against cancer cell line hl-60 were evaluated.resultsthree derivatives were prepared from ligularone and they were identified as 6-oxo-8β-methoxyeremophilenolide (10), epiligularol(11) and epiligularol acetate(12), respectively. eremophilanolides 1-6 showed cytotoxic activities on hl-60 cancer cells with ic50＜10μg/ml and eremophilanolides 7, 8 and 10 exhibited cytotoxic activities on hl-60 cancer cells with ic50 in the range of 10 to 20μg/ml, whereas furanoeremophilanes 9, 11 and 12 showed no cytotoxic activities on hl-60 cancer cells. conclusionligularone, a furanoeremophilane can be converted into an eremophilanolide through photosensitized oxygenation. the lactone group of eremophilane sesquiterpenes is a key active group against leukemia and eremophilanolides with unsaturated c-9 and c-10 showed more activities.

　　key words：eremophilane sesquiterpene;  antitumor;   structure-activity relationship;   leukemia
   
　　艾里莫芬烷倍半萜(eremophilane sesquiterpenes)是菊科千里光族植物中存在的一类特征性化学成分，如千里光族的橐吾属［1］和千里光属［2］等属植物中含有许多该类成分，主要有两种类型：7（8）并呋喃型(furanoeremophilane)和12（8）内酯型(eremophilanolide)。WwW.11665.COm据文献报道艾里莫芬烷倍半萜具有抗肿瘤［1～6］等作用。本文采用mtt法对从橐吾属植物中分离得到的多种艾里莫芬烷倍半萜［7,8］进行了体外抑制人早幼粒白血病细胞（hl-60）生长活性研究。为了进一步探讨该类倍半萜结构与抗白血病活性的关系，为该类倍半萜结构修饰和开发利用提供参考依据，本文还对呋喃倍半萜-橐吾酮进行了结构修饰,研究了橐吾酮的光敏氧化反应。首次探讨了艾里莫芬烷倍半萜抗白血病作用构效关系。

　　1  仪器与材料
   
　　bruker-400型核磁共振波谱仪(bruker公司)； agilent 1100lc/msd trap液相色谱-质谱联用仪(安捷伦公司)； nicolet impact 410 红外光谱仪(thermo nicolet公司)；x-4显微熔点仪(温度未校正)；pe-241mc旋光仪 (perkinelmer公司)；xpa光化学反应仪（南京胥江机电厂）。恒温co2培养箱（德国heraeus）；酶联免疫检测仪（美国bio-rad）。rpmi1640培养基（gibco-brl life technologies inc）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；mtt(sigma公司)。受试化合物：艾里莫芬烷倍半萜化合物1-12（结构见图1）, 纯度≥98% （hplc）；受试化合物溶液(1mg/ml)：用培养液配制，加5%dmso助溶，用0.22μm滤膜过滤除菌。细胞株：人早幼粒白血病细胞hl-60（上海细胞生物研究所）。

　　2  方法与结果

　　2.1   橐吾酮结构修饰以橐吾酮（9）为原料通过光敏氧化转化为内酯倍半萜（10），通过还原和乙酰化反应获得了2个呋喃倍半萜修饰物（11，12）合成路线见图1。

　　2.1.1  橐吾酮（9）的光敏氧化参照文献［9］方法。将橐吾酮770mg、玫瑰红30mg溶于300ml甲醇中，缓慢通入空气，在光化学反应仪中，用汞灯（300w）照射1 h，回收甲醇，残渣溶于4 ml吡啶中，缓慢滴入1ml醋酐，反应物在室温下搅拌过夜，加水终止反应，用醋酸乙酯萃取，石油醚重结晶，得到无色针晶化合物10 (135mg)。
   
　　化合物10：无色针晶（醋酸乙酯），mp 158～159℃，［α］25d=-17.1°（c, 1, chcl3）；分子式：c16h22o4；esi-ms m/z ：301［m+na］+，279［m+h］+； 1h-nmr(acetone-d6，400 mhz)δ：2.11(1h， m，h-1)，1.55(1h， m，h-1)，1.55(1h， m，h-2)，1.30(1h， m，h-2)，1.64(1h， m，h-3)，1.55(1h， m，h-3)，1.97(1h，m，h-4)，2.55(1h，dd，j=13.6，13.6 hz，h-9)，2.21(1h，dd，j=13.6，4.0 hz，h-9)，1.83(1h，m，h-10)，1.91(3h，s，h-13)，1.14(3h，s，h-14)，0.65(3h，d，j=6.8 hz，h-15)，3.13(3h，s，och3)；13c-nmr(acetone-d6，100 mhz)δ：26.1 (c-1)，21.0 (c-2)，30.5(c-3)，38.6 (c-4)，54.7 (c-5)，203.3(c-6)，152.0 (c-7)，108.1(c-8)，37.0 (c-9)，30.3 (c-10)，132.8 (c-11)，170.4 (c-12)，9.2 (c-13)，16.9 (c-14)，13.6 (c-15)，50.9(och3)。文献［9］报道呋喃艾里莫芬烷倍半萜可光敏氧化为内酯倍半萜，化合物10氢谱中没有呋喃烯氢信号，出现了甲氧基氢信号(δ3.13，s)，碳谱中出现了内酯羰基(δ170.4)、缩醛(δ108.1)和甲氧基碳信号(δ50.9)，说明橐吾酮转化成了内酯倍半萜，c-8被甲氧基取代。以上数据与文献［10］化合物6-oxo-8β-methoxyeremophilenolide数据基本一致，故确定化合物10为6-oxo-8β-methoxyeremophilenolide。          

　　2.1.2  橐吾酮（9）的还原按照文献［11］方法用lialh4还原橐吾酮得化合物11，无色结晶。mp 70～72℃，［α］25d=-6.8°（c, 1, chcl3）。分子式：c15h22o2；esi-ms m/z ：257［m+na］+，235［m+h］+；ir νmax(kbr): 3 445，1 654，1 580 cm-1，与文献［11, 12］基本一致，故确定化合物11为epiligularol。

　　2.1.3   epiligularol（11）的乙酰化按照文献［11］方法用乙酸酐将epiligularol乙酰化得化合物12，无色结晶。mp 51～53℃。分子式：c17h24o3；esi-ms m/z ：299［m+na］+，277［m+h］+；ir νmax(kbr):1 738，1 649，1 571cm-1，与文献［11, 12］基本一致，故确定化合物12为epiligularol acetate。

　　2.2  mtt法测定体外抗白血病活性取处于指数生长期状态良好的人早幼粒白血病细胞（hl-60）一瓶，制成细胞悬液，计数约105个/ml，接种于96孔板，100 μl/孔，用含有10%小牛血清的rpmi-1640培养液，于含有5%二氧化碳37℃恒温培养箱中培养12 h，换培养液，加相应浓度受试化合物继续培养48 h，加10 μl mtt(终浓度0.5 mg/ml)置培养箱孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μldmso溶解，平板摇床上振摇5 min，酶联免疫检测仪于570 nm处测吸光值，计算细胞抑制率和半数抑制浓度（ic50）。结果见表1。表1  化合物（1-12）对hl-60细胞生长的抑制活性（略）

　　3  讨论
   
　　由表1可见，内酯艾里莫芬烷倍半萜对hl-60细胞有明显的抑制作用，内酯化合物1～6的ic50＜10 μg/ml，内酯化合物7，8，10的ic50在10～20 μg/ml之间，具有c9和c10位不饱和结构的内酯倍半萜（1～6）活性较强；所有呋喃倍半萜没有抑制活性，而橐吾酮通过光敏氧化转化的产物-内酯倍半萜有抑制活性。初步抗肿瘤活性实验表明, 艾里莫芬烷倍半萜类化合物的12（8）内酯环可能是抗白血病hl-60的关键活性基团，具有c9和c10位不饱和结构的内酯倍半萜活性较强。

【参考文献】
  　［1］park h, kwon s, yoo k. sesquiterpenes from the leaves of ligularia fischeri［j］. planta medica，2000, 66: 783.

　　［2］zhao y, wang p, parsons s. saluenolide a, a novel eremophilanolide from senecio saluensis［j］. chinese chemical letters，2002, 13 (4): 333.

　　［3］zhao y, wang p, hao xj. enantiomeric sesquiterpene lactones from senecio tsoongianus［j］. chinese chemical letters，2002, 13 (8): 754.

　　［4］高坤, 王文蜀, 贾忠建. 假橐吾中四对新的倍半萜结构研究［j］. 化学学报，2003, 61 （7）: 1065.

　　［5］li ew, gao k, jia zj. a new stigmasterol and a new eremophilenolide from ligularia dolichobotrys［j］. chinese chemical letters，2004, 15 (2): 194.

　　［6］李校堃，施树云，杨雷香，等. 具抑制肿瘤细胞生长活性的艾里莫芬双内酯二聚体及用途［p］. 中国专利，申请号200710067459.3，2007-3-13.

　　［7］刘建群，张朝凤，张 勉，等. 宽舌橐吾的化学成分研究［j］. 中国药科大学学报, 2005, 36(2)：114.

　　［8］刘建群，张朝凤，王峥涛，等. 宽舌橐吾的化学成分研究(ii) ［j］. 中国天然药物, 2005，3（6）: 340.

　　［9］naya k., nog n., makiyama y.. the photosensitized oxygenation of furanoeremophilanes. ii. the preparation and stereochemistry of the isomeric hydroperoxides and the corresponding lactones from furanofukinin and furanoeremophilane［j］. bulletin of the chemical society of japan, 1977, 50 (11): 3002.

　　［10］naya k., kanazawa r., sawada m.. the photosensitized oxygenation of furanoeremophilanes.ⅰ. the isomeric hydroperoxides from petasalbin and their transformations to lactones［j］. bulletin of the chemical society of japan, 1975, 48 (11): 3220.

　　［11］ishii h., tozyo t., minato h.. studies on sesquiterpenoids-ⅸ structure of ligularol and ligularone from ligularia sibirica cass［j］. tetrahedron, 1965, 21(9): 2605.

　　［12］motoot., aki w., sachie m.. diversity of ligularia kanaitzensis in sesquiterpenoid composition and neutral dna sequences［j］. tetrahedron, 2008, 64: 4486.