作者：唐乾利，俞渊，黄名威，关中正，高善辉
【摘要】 目的探讨大黄灵仙胶囊对慢性肝损伤家兔胆结石形成的干预作用及其作用机制。方法将46只家兔随机分为正常组、慢性肝损伤组、肝硬化组、大黄灵仙胶囊大剂量组、大黄灵仙胶囊小剂量组。采用皮下注射ccl4方法进行慢性肝损伤造模,各组同时进行不同处理。最后观察各组胆囊成石率，肝脏功能生化指标，肝组织病理改变、超微结构改变，胆汁成分改变。结果①慢性肝损伤组、肝硬化组胆石形成阳性检出率较正常对照组显著增加（p＜0.05或p＜0.01）。大黄灵仙胶囊大剂量组、大黄灵仙胶囊小剂量组胆石阳性检出率较肝硬化组有显著降低(p＜0.01或p＜0.05)。②各模型组中肝脏超微结构均发生不同程度异常改变，大黄灵仙胶囊大、小剂量治疗组肝脏病理改变、肝细胞超微结构改变较模型组比较均有改善，大剂量组尤为明显。③大黄灵仙胶囊大、小剂量组血清ast，alt，γ-gt，非结合胆红素均明显低于肝硬化组（p＜0.05或p<0.01）；总胆红素、间接胆红素、钙离子大黄灵仙胶囊大、小剂量组较肝硬化组明显降低（p<0.01），大剂量组较小剂量组明显降低（p<0.01）。结论大黄灵仙胶囊对慢性肝损伤后胆结石形成具有明显的预防效果，其作用机制主要与抑制ccl4所致肝脏损伤的作用有关，同时与大黄灵仙胶囊在多层次、多途径调节参与结石形成各因素关系密切。Www.11665.COm
【关键词】 慢性肝损伤； 肝硬化； 大黄灵仙胶囊； 胆结石； 肝脏超微结构
abstract：objectiveto study the interference effect and its mechanism of dahuanglinxian capsules on gallstone formation after chronic liver injury of rabbits. methods46 rabbits were randomly divided into 5 groups, respectively named by group a (normal control group), group b (chronic liver injury group), group c (liver cirrhosis group), group d (group fed with large dose dahuanglinxian capsule) and group e (group fed with large dose dahuanglinxian capsule). the chronic liver injured rabbits were induced by subcutaneous injection with ccl4 and each group was treated by different factors at the same time. the gallstone formation rate, liver function biochemical index, pathological changes in liver tissues, ultrastructural changes, and biliary component change were observed by the methods of biochemical and pathological technology. results①the gallstone formation rate of group b and c were obviously higher than group a (p＜0.05 or p＜0.01). the gallstone formation rate of d and e were obviously lower than group c (p＜0.05 or p＜0.01). ②there were abnormal ultrastructural changes to certain extent in models b and c. compared with the model groups, the d and e groups improved the ultrastructural changes and pathological changes in liver tissues, especially d group. ③the level of ast，alt，r-gt and indirect bilirubin in serum of groups d and e were obviously lower than group c (p＜0.05 or p<0.01). at the same time, the content of total bilirubin, indirect bilirubin, ca2+ of groups d and e were obviously lower than group c (p<0.01), the same of group d was lower than group e (p<0.01). conclusionthe dahuanglinxian capsules have significant effect of preventing gallstone formation due to its protective effect to liver injury which is induced by ccl4, and its association with regulations to many factors participating in the gallstone formation on multiple levels and ways.
key words： chronic liver injury； cirrhosis of liver； dahuanglinxian capsule； gallstones； ultrastructure
本实验利用ccl4皮下注射诱发家兔慢性肝损伤，在此基础上观察胆囊结石形成率，并用大黄灵仙胶囊组方煎剂进行灌胃，通过观察结石形成率，肝脏细胞超微结构的病理学改变，测定实验动物肝功能及胆汁成分并进行胆汁培养，以探讨大黄灵仙胶囊对家兔慢性肝损伤胆结石模型的干预治疗作用。
1 材料与仪器
1.1 材料、仪器健康家兔，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，普通级，广西中医学院实验动物中心提供，合格证号20060820。各生化试剂盒分别购于上海申能德赛诊断技术有限公司和伊利康生物技术有限公司。奥地利biocell2010酶标仪、日立h-500透射电镜、bx-50-32001奥林巴斯光学显微镜、hpias-1000p病理图文分析系统等分别由广西医科大学中心实验室、广西中医学院一附院病理实验室提供。
1.2 药品造模用药：ccl4 分析纯（将ccl4与花生油以1∶2.5比例混合，37℃加热使充分溶解，制成40％ccl4溶液，）、胆固醇分析纯，均为上海国药集团产品。受试用药：大黄灵仙胶囊［1］ (生大黄150 g，威灵仙300 g，芒硝100 g，金钱草300 g，枳壳120 g，鸡内金100 g，泽兰150 g，柴胡120 g，郁金120 g，磁石120 g，黄芪300 g，甘草50 g)，以上共计1 930 g生药，由广西中医学院第一附属医院制剂室提取965 ml浓缩药液，并无菌密封瓶装（生药量为2 g /ml）。
2 方法
2.1 动物分组及处理方法健康家兔46只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，适应性喂养1周后随机分为5组，即正常对照组10只、慢性肝损伤组8只、肝硬化组8只、大黄灵仙胶囊大剂量组10只（用药量相当于成人用量的3倍）、大黄灵仙胶囊小剂量组10只（用药量相当于成人用量）。正常对照组普食喂养，每日灌服生理盐水4 ml/kg；慢性肝损伤组采用“慢性肝损伤兔动物模型”的建立［2］，普食喂养10周后，每日灌服生理盐水4 ml/kg；肝硬化模型组造模方法［2］：家兔称重后以2 ml/kg体质量，将40％ccl4溶液颈后皮下注射，每4天1次，以形成皮下丘状突起为宜［3］。造模后第10周开始每日灌服生理盐水8 ml/kg；大黄灵仙胶囊大、小剂量组第10周起每日灌服胆通胶囊提取液8 ml/kg，4 ml/kg。普食喂养。
2.2 检测指标及方法
2.2.1 胆囊结石成石观察结石判定标准为正常胆囊胆汁内无有形成分。肉眼观察胆汁内有无棕黑色成型颗粒或泥沙样沉淀；镜下观察有无结石微粒或结晶。
2.2.2 生化指标检测天门冬氨酸氨基转移酶（ast）、丙氨酸氨基转移酶（alt）、γ-谷氨酰转肽酶(γ-gt)采用速率法检测；血清中总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、血清总胆固醇、总胆汁酸、胆汁总胆汁酸、总胆固醇采用化学比色法检测；钙离子含量采用乙二胺四乙酸二钠法检测；磷脂含量酶显色法检测。
2.3 统计学处理所有数据采用spss14.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，两组间均数比较用t检验；两组间率的比较采用卡方检验；p＜0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 家兔胆囊结石发生情况结果见表1。表1 胆石发生情况（略）
3.2 家兔肝脏病理改变光镜下观察，慢性肝损伤组（见图1，2）：纤维组织增生，肝细胞水肿，局部气球样变，胆管增生，少许淋巴细胞浸润，汇管纤维间隔稍增宽。肝硬化组（见图3～4）：见假小叶形成，小叶内中央静脉缺如，细胞排列紊乱，多数细胞水肿，局部气球样变，小胆管增生、伴有淋巴细胞浸润。大黄灵仙大剂量组（见图5～6）：细胞排列规则，少数肝细胞水肿，小叶结构清晰，汇管区结构正常，无炎性细胞浸润，未见小胆管增生。大黄灵仙小剂量组（见图7～8）：肝细胞排列规则，中度水肿，局部气球样变，汇管区纤维增宽，胆管增生，少量淋巴细胞浸润。
3.3 家兔电镜肝细胞超微结构的改变电镜观察：大黄灵仙小剂量治疗组图（见图9～12）：正常结构可见，大量滑面内质网、大量胶原纤维。线粒体固缩，嵴可见。大黄灵仙大剂量治疗组(见图13～16)：正常结构可见，糖原多，滑面内质网多，粗面内质网少，大量胶原纤维。核模较完整，线粒体多正常。
3.4 家兔血清天门冬氨酸氨基转移酶（ast）、丙氨酸氨基转移酶（alt）、γ-谷氨酰转肽酶(r-gt)含量分析结果见表2。表2 血清ast，alt，γ-gt含量比较（略）
3.5 血清总胆红素（tbil）、直接胆红素（dbil）、间接胆红素（ibil）含量分析结果见表3。表3 血清tbil，ldbi，libil含量比较（略）
3.6 家兔血清总胆固醇（tc）、总胆汁酸（tba）、磷脂（pl）含量分析结果见表4。表4 血清tc、tba、pl含量比较（略）
3.7 家兔胆汁总胆固醇（tc）、磷脂（pl）、钙离子(ca2+)含量分析结果见表5。表5 胆汁tc、pl、ca2+含量比较（略）
3.8 家兔胆汁总胆汁酸（tba）、总胆红素（tbil）、间接胆红素（ibil）的含量分析结果见表6。表6 胆汁tba、tbil 、ibil含量比较（略）
4 讨论
胆结石的发病机制至今仍未完全阐明，既往研究表明，胆结石的形成是多种因素综合作用的结果。因此研究慢性肝损伤与胆石症发生之间的关系有重要意义。胆结石伴有肝脏的组织学改变，尤其是胆管结石。可能的主要机制是胆道内压力升高，通过胆道炎症、胆道梗阻等原因，使胆囊内压力升高，继发胆道压力升高，从而造成肝内胆汁淤滞，导致肝细胞损害［4,5］。有学者认为胆囊结石病伴随的肝脏损害，很可能是胆囊结石的成因，它可能先于胆囊结石而存在，而胆囊结石病的反复发作可能反过来加重原发性肝损害， chignard n［6］进一步提出肝细胞合成分泌胆汁机制受损有可能是胆囊结石患者所存在的一系列肝胆道病理状态的启动扳机。而肝脏的损害首先就表现在肝细胞的超微结构的改变上，滑面内质网的减少和代偿性增生表明催化胆固醇转化为胆汁酸的7α羟化酶数量和活力有可能受到影响，以致于胆汁酸合成减少，从而造成胆汁中胆固醇与胆汁酸比例增高，增加了成石的机率［7］。本次实验发现各模型组家兔的肝脏超微结构均伴有不同程度的改变，存在有不同程度的膜破裂，质浆中的粗面内质网和高尔基复合体水肿、变性，线粒体坏死，双层模结构消失，部分甚至有空泡样变，滑面内质网减少，粗面内质网部分断裂，颗粒减少，溶酶体增加，肝细胞边界模糊不清，细胞质电子密度减少等各种相应结构改变。肝硬化组表现尤其明显，ast较慢性肝损伤组有著性差异（p＜0.01）；γ-gt较慢性肝损伤组有明显差异（p＜0.05）。
本实验结果显示，肝硬化家兔胆囊结石发生率为83.3％，慢性肝损伤组胆囊结石发生率为63％，而正常对照组为0。前两者与正常对照组比较均有显著差异（p＜0.05，p＜0.01）。肝硬化组与慢性肝损组比较，胆囊结石阳性检出率没有明显差异，但肝硬化组胆囊胆汁可见有形成分较慢性肝损组明显居多，且后者胆汁中以胆泥为主。目前已有实验证明胆泥形成是胆石形成的必经阶段［8］，肝硬化的病程越长，合并胆囊结石的危险性越大，本次实验结果更进一步证实了这一结论。
本实验光镜、电镜观察发现：慢性肝损伤组与肝硬化组动物中形成的结石为棕绿色和黄褐色，胆石中存在较多的是胆色素颗粒而仅有少量胆固醇结晶，不同于高胆固醇膳食组，这一结论提示：在慢性肝损伤状态下胆石的成因机制中，胆色素类结石是其形成机制之一。
实验中发现慢性肝损伤组家兔胆囊几乎均为针尖样胆沙，而随着造模时间的延长，肝硬化组家兔胆囊中出现1 mm左右大小的结石，光镜观察不同于高胆固醇膳食组的胆固醇结晶。结合对其胆汁成分的分析，我们发现胆固醇组胆汁中的胆固醇含量显著高于正常对照组（p＜0.05），慢性肝损伤组与肝损伤胆固醇组与正常组没有明显差异，而肝硬化组胆固醇含量低于正常组。肝硬化组胆汁胆红素高于其他各组（p＜0.05）。此结果提示：饮食中的胆固醇过量，可导致胆汁中形成胆固醇过饱和，随后胆固醇结晶，结晶析出逐渐形成结石。
中医学认为肝胆互为表里，肝主疏泄，胆汁的排泄有赖于肝的疏泄功能，肝的疏泄功能直接控制和调节胆汁的排泄。肝失疏泄主要表现为气机不畅、气机郁结之病理变化，也称“肝气郁结”。情志不畅，饮食不洁、虫积或痰浊瘀血内结于肝胆等原因均可引起肝胆疏泄失常，导致肝胆气郁，郁久化热，湿浊内生，湿热内盛，蕴结肝胆，湿热熏蒸，煎熬胆汁而导致胆石。此病机正同西医认为的“肝脏功能障碍，特别是肝细胞功能障碍而致病理性胆汁分泌和排胆功能障碍是胆结石形成的基础” 之理论相一致。同时中医认为胆汁排泄不畅，亦会影响肝之疏泄，即所谓的“胆病及肝”，这与西医的“肝细胞功能损害与胆结石可能是互为因果”理论相一致。
大黄灵仙胶囊为治疗胆石病的有效中药制剂，方中大黄、芒硝攻下导滞、利胆排石；金钱草、郁金、柴胡、枳壳、泽兰相伍，既有清热利湿之功，又有理气祛痰之效；鸡内金、金钱草、威灵仙为排石佳品；威灵仙、磁石为经验用药；黄芪、甘草意在益气补虚，保护胃气。诸药合用共奏疏肝利胆，攻下排石的功效［1］。其预防色素性结石的作用与其在保护肝细胞和胆囊组织，维持胆汁有形成分代谢的正常化以及抑菌抗菌等多重作用有关［9］。
胆汁中胆汁酸含量降低，未结合胆红素含量升高，可能是其形成结石的主要原因［10］。本次实验发现，大黄灵仙胶囊对肝损伤家兔胆汁中的胆汁酸、钙离子和胆固醇水平有影响，可以明显增加肝损伤家兔胆汁中胆汁酸的含量，降低钙离子的含量且大剂量组较小剂量组增加胆汁酸的作用为优；中药大黄灵仙胶囊对四氯化碳所致的肝损伤家兔的肝脏的损伤有一定的预防作用和对在肝损伤基础上诱发的胆囊结石有明显的干预作用。
慢性肝损伤在是临床上较为常见的肝损伤。肝炎病毒性肝损伤、酒精性肝损伤、药物性肝损伤、代谢性肝损伤、胆道疾病引起继发性肝损伤以及环境污染食品引起的肝损伤等都属于慢性肝损伤的范畴。但目前由胆道疾病引起的肝损伤却从未引起人们的重视，慢性肝损伤与胆结石的关系尚未有人明确提出。因此，研究慢性肝损伤与胆结石的形成密切相关，从肝细胞损伤的角度治疗胆石病具有十分重要的意义。
本次实验仅对慢性肝损伤与胆结石的相关性、肝损伤家兔基础上诱导建立胆石症模型的可行性及中药大黄灵仙胶囊的干预作用做了初步的探讨和分析，随着分子生物学的研究的深入，家族分析及家系研究的进展，人们对胆石成因的研究逐渐推向基因领域。目前对胆石基因的研究取得了一定的进展，对影响胆石形成各因素的基因调控也有了一定的认识，如以基因（或蛋白）表达为指标，以基因调控改变和功能修饰为研究方向，进行防止胆石病有效中药复方多组分的多环节、多靶点调整的研究，可望对临床有效中药复方的作用机理研究取得突破性进展。
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