作者：冯丽娜，邓亦峰，梁念慈
【摘要】 目的提取分离高良姜芳香类化合物中的辣味部位，并对辣味部位与其余部分的镇痛、抗炎、抗菌活性进行比较分析。方法采用真空液相色谱法分离高良姜芳香类化合物，并以离线tlc-ms及化学显色法进行鉴别；分别以体外抗菌实验、热板法、醋酸扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀及毛细血管通透性增加模型进行抗菌、镇痛和抗炎活性评价。结果提取出的高良姜芳香类化合物主要为黄酮类和二苯基庚烷类化合物，后者为辣味部位；黄酮类化合物的抗菌、镇痛、抗炎作用与高良姜芳香类提取物相当。结论高良姜芳香类化合物的抗菌、镇痛和抗炎活性成分主要为黄酮类化合物，辣味部位可分离出来另作特色开发，这样更有利于拓宽高良姜药用资源的用途。
【关键词】 高良姜； 芳香类化合物； 镇痛； 抗炎； 抗菌
高良姜是姜科植物高良姜alpinia officinarum hance的干燥根茎，具有温中、散寒、止痛、解痉等功效,临床上常用于胃寒呕吐、脘腹冷痛等病证的治疗［1］。近年来发现高良姜中的黄酮及二苯基烷等芳香类化合物具有较强的镇痛［2，3］、抗炎［4，5］、抗菌［6，7］、抗病毒、抗癌、抗氧化等作用，成为研究的热点。wwW.11665.coM但由于高良姜具有强烈的辛辣味，使其在医药、食品等方面的应用开发受到了限制。本文提取出高良姜芳香类化合物并分离出其中的辣味组分，对分离前后各组分的镇痛、抗炎、抗菌活性进行评价和对比，探讨辣味组分的分离对其活性的影响，为拓展高良姜的综合利用和特色产品开发提供科学依据。
1 材料
1.1 材料与试剂
高良姜，人工种植3年，采于广东徐闻龙塘镇八角村。注射用双黄连冻干粉剂（哈药集团中药二厂）；消炎痛（山西云鹏制药有限公司）；伊文思蓝（fluka，进口分装）；牛肉膏、蛋白胨、水解酪蛋白、琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）；醋酸乙酯、无水乙醇、石油醚等均为国产分析纯。
1.2 动物
spf级km雌性小鼠，（20±2）g，1～1.5月龄，由本院实验动物中心提供。
1.3 菌种
金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，白色念珠菌，由本院病原生物学实验室提供。其中金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌采用mh培养基，培养24 h；白色念珠菌采用沙保培养基，培养48 h。
1.4 仪器
高效液相色谱-质谱联用仪（岛津lcms-8000α型），旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；超声清洗仪（上海必能信超声有限公司）；电热恒温水浴锅（上海悦丰仪器有限公司）；752c紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。
2 方法与结果
2.1 提取与分离高良姜干燥根茎粉末（40目），以醋酸乙酯在室温下超声提取3次，30 min/次，提取液减压浓缩成浸膏；浸膏以72%乙醇和石油醚体系分离，分取浓缩分别制得72%乙醇提取物ⅰ和石油醚提取物ⅱ；提取物ⅰ采用真空液相色谱（vlc），以石油醚-醋酸乙酯体系（7∶3～5.5∶4.5）进行梯度洗脱，在tlc及感官检测下，分别收集和浓缩得辣味部分ⅲ和非辣味部分ⅳ。
采用离线tlc- ms及化学显色法对高良姜提取物中已有文献报道的化合物进行鉴别，表明提取物ⅰ中主要含有高良姜素，山萘酚，高良姜素-3-甲醚，乔松素，山萘素-4'-甲醚，1-苯基-7-（3'-甲氧基-4'-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮等芳香类化合物；ⅳ中主要含有高良姜素等黄酮类化合物；ⅲ中主要成分为二苯基庚烷类化合物，其中不含黄酮。
2.2 镇痛实验
2.2.1 热板法
取（20±2）g雌性小鼠，置（55±0.5）℃的金属热板上，以小鼠自足底接触热板至出现舔后足所需时间（s）作为痛阈值。舔足时间＜5 s、＞30 s或跳跃者视为不合格，剔除。选取99只合格小鼠随机分为11组，各组按剂量腹腔注射给药，于给药后30，60，90，120 min分别测定各小鼠的痛阈值（＞60 s，以60 s计）。采用spss软件统计分析。 结果表明，ⅰ，ⅲ，ⅳ各剂量均能增加小鼠痛阈值，具有显著的镇痛作用。结果见表1。表1 高良姜各药液对小鼠热板致痛的影响（略）
2.2.2 醋酸扭体法
雌性小鼠99只，（20±2）g，随机分为11组。按剂量腹腔注射给药，于给药后30 min，腹腔注射0.8％醋酸生理盐水（0.1 ml/10 g）。记录注射醋酸溶液后20 min内小鼠出现扭体的次数。采用spss软件统计分析，比较组间差异，计算药物镇痛抑制率。结果表明，ⅰ、ⅲ、ⅳ各剂量均能有效抑制因醋酸刺激腹腔粘膜引起的痛反应，效果优于消炎痛。结果见表2。表2 高良姜各药液对醋酸致小鼠扭体反应的影响（略
2.3 抗炎实验
2.3.1 对二甲苯致小鼠耳片肿胀的影响
雌性小鼠99只，（20±2）g，随机分为11组。按剂量腹腔注射给药，给药后30 min，于每只小鼠右耳片(两面)均匀涂抹二甲苯0.03 ml以诱发炎症，左耳不涂二甲苯作为对照；立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝（0.1 ml/10 g）。30 min后将小鼠颈椎脱臼处死,沿耳廓基线剪下双耳，用直径为8 mm的打孔器在左、右耳同一部位打下圆耳片、称重,右耳与左耳重量之差即为肿胀度。采用spss软件统计分析，比较药物的抗炎作用，计算肿胀抑制率。结果表明，ⅰ、ⅳ各剂量均能显著降低二甲苯致小鼠耳片肿胀度，且呈现一定的量效关系，其中高、中剂量效果尤为显著，优于消炎痛；ⅲ无明显的作用。结果见表3。表3 高良姜各药液对二甲苯致小鼠耳片肿胀度的影响（略）
2.3.2 对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
上述实验称重之后，将左右耳片剪碎，浸入2 ml丙酮-生理盐水（7∶3）的溶液中，在38℃水浴48 h条件下浸出染料；离心,上清液于590 nm处比色，测光密度值。采用spss软件统计分析，比较药物对毛细血管通透性的影响。结果显示，ⅰ、ⅳ各剂量均能有效地抑制小鼠毛细血管通透性，且其抑制效果随剂量呈现一定的量效关系，其中ⅳ高剂量效果尤为显著，优于消炎痛；ⅲ无明显的作用。结果见表4。表4 高良姜各药液对二甲苯致小鼠耳片肿胀度的影响（略）
2.4 体外抗菌实验
将ⅰ、ⅲ、ⅳ用灭菌mh（沙保）液体培养基稀释为100 mg/ml生药（双黄连为400 mg/ml）的溶液作为原液，备用。采用液体试管二倍稀释法，将各药液用mh（沙保）液体培养基连续稀释至第10管，第11管不加药液作为阳性对照，然后分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌107cfu，40 μl，第12管不加药液和菌液作为阴性对照，各2个平行。置37℃恒温箱中培养24 h（48 h），观察各菌的生长情况。以无肉眼可见菌生长的最低药物浓度为该药的最低抑菌浓度（mic）。
将上述未见菌生长各管的培养物混匀后，吸取0.1 ml均匀涂布于mh或沙保琼脂平板上，各2个平行，置37℃恒温箱中培养24 h（48 h），观察结果。以菌落平均数少于5个的最低药物浓度作为该药的最低杀菌浓度（mbc）。结果表明，ⅰ、ⅲ、ⅳ对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌及白色念珠菌有不同程度的抑菌和杀菌作用，其中ⅳ的作用最强，ⅰ次之，ⅲ较差，作用均强于双黄连；但ⅰ、ⅲ、ⅳ对大肠杆菌均无作用。结果见表5。表5 高良姜各药液对4种菌的mic与mbc（略）
3 讨论
高良姜作为食药两用的天然植物在我国已有上千年的历史，富含黄酮类、二苯基庚烷类和挥发油类活性成分。由于高良姜芳香强烈、口感极其辛辣，使其在医药、食品等方面的应用开发受到了限制。将其中的挥发油、辛辣成分、黄酮类成分分别提取出来，可实现高良姜药用资源的综合开发、物尽其用。本实验成功地将高良姜提取物ⅰ中的辣味物质分离出来，并对分离后各部分的镇痛、抗炎、抗菌活性进行了比较分析。实验表明，高良姜提取物ⅳ有显著的镇痛和抗炎作用，且活性呈剂量依赖性，对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌及白色念珠菌具有较强的抑菌和杀菌作用，其作用与提取物ⅰ基本相当。由此可以得出结论：高良姜芳香类化合物的抗菌、镇痛和抗炎活性成分主要为黄酮类化合物，辣味部位可分离出来另作特色开发，这样更有利于拓宽高良姜药用资源的用途。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典,i部［s］.北京:化学工业出版社,2005:202.
［2］吴清和,荣向路，黄 萍，等.高良姜素的药效学研究［j］.中药材,2000,23(11):699.
［3］朱自平,陈光娟,张明发，等.高良姜的温中止痛药理研究［j］.中药材,1991,14(10):37.
［4］张明发,段泾云,陈光娟，等.高良姜温经止痛的药理研究［j］. 陕西中医,1992,13(5):232.
［5］yadav pn, liu z, rafi mm. a diarylheptanoid from lesser galangal (alpinia officinarum) inhibits pro-inflammatory mediators via inhibition ofmitogen-activated protein kinase, p44/42,and transcription factor nuclear factor-kappa b［j］. j pharmacol exp ther.2003,305(3):925.
［6］a folayan-aj. the antimicrobial activity of 3, 5, 7-trihydroxyflavone isolated from the shoots of helichrysum aureonitens［j］. j-ethnopharmacol,1997,aug,57(3):177.
［7］宫毓静,安汝国,虞 慧，等.164种中药乙醇提取物抗真菌作用研究［j］.中草药,2002,33(1):42.
