作者：周春丽，李玉萍，刘建涛，胡娜，刘华，苏虎

【摘要】  目的探讨马齿苋多糖（pps）对糖尿病小鼠预防作用的分子机制。方法应用基因芯片技术比较pps处理组和生理盐水对照组糖尿病小鼠的基因表达差异。结果pps组上调基因1条，下调基因1条，上调基因和糖尿病的发生有关，下调基因和氧化还原法应相关。结论马齿苋多糖能预防或延缓糖尿病小鼠糖尿病的发生。

【关键词】  马齿苋多糖； 糖尿病； 基因芯片

　　abstract：objectiveto investigate the molecular mechanism underlying the preventive effect of portulace oleracea polysaccharide on diabetes mellitus in mice. methodsin order to explore the gene expression  profiles of portulace oleracea polysaccharide mice's islet cells treated with pps,cdna microarray technique was applied.  results1 gene up-regulated was related to  diabetes mellitus , 1 gene down-regulated was oxidation-reduction reaction.conclusionportulace oleracea polysaccharide probably prevent or delay diabetes mellitus in mice.

　　key words：portulace oleracea polysaccharide ;   diabetes;    gene chip
   
　　糖尿病（diabetes mellitus, dm)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的体内糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱,以持续高血糖和伴发多种并发症为特征的一种临床综合征。WWw.11665.com主要分为1型(胰岛素依赖型糖尿病,insulin-dependent diabetes mellitus, iddm)和2型(胰岛素非依赖型糖尿病,non-insulin-dependent diabetes mellitus, niidm)。1型糖尿病是一种在遗传基础上由环境因素触发的慢性自身免疫性疾病，以胰岛β细胞特异性损伤，不能合成和分泌胰岛素为特征；2型糖尿病是因胰岛素分泌相对不足或外周组织的胰岛素抵抗所致，占成人患者的95%以上［1，2］。虽然目前对糖尿病发病机理的认识还不十分清楚，但多年来许多学者的研究结果表明无论是1型还是2型糖尿病都存在功能性胰岛β细胞的缺失现象，并伴有相同的并发症，同时，针对相关调控基因人们也在研发大量新药。然而，迄今为止,除胰岛移植治疗外治疗糖尿病药物多为单一效应，只能控制血糖，并不能防止高血糖累积肾脏、神经、视网膜、心血管等所致的糖尿病慢性并发症（diabetic chronic complications, dcc）的发生，包括失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变等。马齿苋多糖（portulaca oleracea l.polysaccharide,pps)是马齿苋的主要有效成分［3］，具有提高人体免疫力、防治癌症、抗氧化、抗衰老等作用［4～6］。用pps预处理小鼠可以明显降低糖尿病模型小鼠的血糖和改善其糖耐受量异常，且与pps浓度和时间成正相关性［7］。本研究运用基因芯片技术，观察pps对糖尿病模型小鼠胰岛基因表达的影响。

　　1    材料与仪器

　　1.1  原料

　　新鲜马齿苋portulaca oleracea l.于2005-09购于江西南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，80℃鼓风干燥6 h，粉碎备用。准确称取马齿苋粉末50g，按照1∶30(w∶v)加入蒸馏水，水煎煮3次（1.5，1.0，0.5 h），过滤，合并3次提取液，浓缩提取液，冷却后4 000 r/min离心15 min，取上清液，以无水乙醇调制终浓度为75％，4℃静置过夜，沉淀物再分别以无水乙醇、丙酮、乙醚回流洗涤，得灰白色粗多糖粉末，以适量蒸馏水溶解粉末，置4℃冰箱备用。临用时用蒸馏水配制成0.2和2 mmol/l粗多糖溶液。

　　1.2   动物

　　4周龄昆明糖尿病小鼠20只（20～22 g，雄性，购自江西省医学实验动物中心），经随机编号进入①pps处理组（10只），口服pps 2 mmol/l 2ml·d-1 30 d；②对照组（10只），口服等量生理盐水30 d。每周测定血糖（尾静脉采用血法），观察8周处死小鼠；新鲜胰腺放-80℃冰箱备用。

　　1.3  试剂和仪器

　　各种纯化总rna的试剂、dntp由promega 公司提供，逆转录酶及缓冲液由gibco brl公司提供，taq酶由上海生物工程公司提供；cy3-dutp、cy5-dutp 由amersham phamacia 公司提供，oligotex total-rna midi kit 购自ouagen公司。
   
　　heraeust12高温烘箱，sorvall evolution rc型离心机，旋转蒸发仪(re-52aa)，philips comfort粉碎机，生物芯片研制系统。

　　2  方法

　　2.1  mrna提取    

　　2.1.1  用一步法分别抽提20只小鼠总rna具体步骤：①取 100 mg 新鲜胰腺组织置1.5 ml离心管中，加入 1 ml trizol 充分匀浆，室温静置5 min ；②加入 0.2 ml 氯仿，振荡 15 s，静置 2 min；③4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 15 min，取上清液；④加入 0.5 ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min ；⑤4 ℃ 离心， 12 000 g 离心 10 min，弃上清液；⑥加入 1 ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 ℃， 7 500 g 离心 5 min ，弃上清液；⑦晾干，加入适量的 depc h2o 溶解（ 65 ℃ 促溶 10～15 min） 。

　　2.1.2  从总rna中分离mrna①取上述提取的总rna若干（少于0.25 mg）到一个新的无rnase 的ep管中，用无rnase的水定容到250 μl；②加入buffer obb 250 μl, oligotex suspension 15 μl。用tip打匀或用手弹匀；③70℃水浴，3 min（裂解rna的二级结构）；④20～30℃条件下，静置10 min（让oligotex与mrna结合）；⑤高速离心2 min，小心吸走上清液（该上清液要保留），留下约50 μl的上清液在原管里；⑥用buffer ow2 400 μl重悬含oligotex/mrna复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml ep管的spin柱子上，高速离心1 min；⑦将spin柱子移到一个新的ep管上，加buffer ow2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液；⑧将spin柱子移到一个新的ep管上，加20～100 μl热的（70℃）buffer oeb到柱子上，用tip来回吸打3～4次，高速离心1 min；⑨为保证最大的 mrna产量，可再次重复第8步；⑩电泳。

　　2.2  杂交和洗片将基因芯片（上海博星基因芯片有限公司）和杂交探针分别在95℃水浴中变性5 min，将探针加在基因芯片上，用盖玻片封片，置于60℃杂交15～20 h，然后揭开盖玻片，分别用2ssc+0.2%sds、0.1%ssc+0.2%sds、0.1%ssc洗涤10 min，室温晾干。

　　2.3  检测与分析用基因公司的扫描仪 dnascop tmlm（激光共聚焦）扫描芯片，用imagene3.0软件分析cy3和cy5两种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行cy3和cy5的均衡。用以下两个条件作为判定基因差异表达的标准：①cy5/cy3（比值）＞2或＜0.5；②cy3或cy5荧光信号强度＞800。

　　3  结果

　　3.1  mrna提取结果 通过紫外分析和琼脂糖凝胶电泳鉴定，od260/od280 在1.8以上，电泳呈现28 s，18 s，5 s清晰条带，其中28 s与18 s比值为2，显示获得高质量总rna且rna未被降解。采用oligotex total-rna midi kit分离纯化为mrna。

　　3.2  芯片差异表达健康小鼠和糖尿病小鼠胰腺组织中差异表达的部分基因比值转移生长因子tgf-β为2.451，表现上调，一氧化氮合酶基因（nos）比值为0.203，表现为下调。

　　4  讨论
   
　　糖尿病的发病机理尚不十分清楚，近年来通过细胞培养方法和动物模型的确立的研究，发现糖尿病发病机理与自身免疫性反应、活性氧自由基（reactive oxygen species, ros）、转移生长因子β（transforming growth factor-β, tgf-β）等因素有关。 在遗传易感性的基础上，病毒感染或化学毒物等外界因素诱发胰腺炎（糖尿病发生的初期阶段），巨噬细胞或t细胞浸润胰岛并将其激活，分泌细胞因子、ros等介导因子，引起自身免疫性反应，促进胰岛β细胞功能损伤和死亡［8］； ros、葡萄糖自身氧化产生的自由基代谢产物（advanced glycation end products, ages）、组织损伤产生的自由基及自由基引发的脂质过氧化等恶性循环的刺激下,加重了胰岛β细胞及全身多个系统受到损伤,诱发糖尿病及其慢性并发症［9，10］;虽然细胞和动物实验以及临床试验研究证明，抗酸化、降血糖等对症治疗有一定的保护作用［11］，但仍未取得满意的效果。随着对 tgf-β研究的深入，发现胰岛发生过程中tgf-β信号途径的破坏将减弱胚胎胰岛β细胞分化能力［12，13］，tgf-β信号途径是确定成熟胰岛β细胞的特性和维持分泌功能所必需的［14］。但在成熟胰岛β细胞中tgf-β信号活性的过多表达将引起毁坏性效应［13］。同时，tgf-β是调节细胞凋亡的重要细胞因子，也是细胞增殖与细胞外基质合成的重要调节因子，它能够引起细胞外基质合成增加和组织纤维化，是糖尿病慢性并发症的主要原因［15，16］。因此，tgf-β信号也许可作为防治糖尿病及其慢性并发症的发生发展新策略的靶分子。在本实验中也发现了tgf-β基因表达上调。与此同时也发现了和氧化还原反应相关的基因——一氧化氮合酶基因（nos）表达下调。这一结果与利用黄芪多糖基因表达的差异相一致［17］。
   
　　综上所述，马齿苋多糖能抑制胰岛细胞的凋亡，减轻氧自由基对胰岛细胞的毒性作用，从而起到预防或延缓糖尿病的作用。马齿苋多糖因其天然性、无毒性、来源广泛、提取方便，有望成为糖尿病免疫干预治疗的药物。

【参考文献】
  　［1］paul zimmed, k.g.m.m. alberti and jonathan show. global and societal implications of the diabetes epidemic［j］. nature. 2001,414(13) 782.

　　［2］eyre h, kahn r, robertson rm, et al.preventing cancer, cardiovascular disease, and diabetes: a common agenda for the american cancer society, the american diabetes association, and the american heart association［j］. . circulation. 2004 jun 29,109(25):3244.

　　［3］周春丽, 苏 虎, 王德解，等. 马齿苋有效成分的提取及定量［j］. 时珍国医国药, 2008,19(8):1933.

　　［4］卢新华，何军山，朱湘忠.马齿苋多糖对小鼠免疫功能影响的研究［j］. 中药药理与临床，2006，22（3）：89.

　　［5］段玉峰, 韩果萍. 马齿苋多糖组分的分离纯化及抗氧化活性研究［j］. 食品科学, 2005,26（3）：225.

　　［6］王晓波，刘殿武，王立芹，等.马齿苋多糖对s180荷瘤小鼠免疫功能的影响［j］. 天然产物研究与开发，2005，17（4）：453.

　　［7］李玉萍,刘志勇,谢国秀,等.马齿苋多糖抗糖尿病作用的实验研究［j］. 天然产物研究与开发，2008,20:813.

　　［8］kukreja a, maclaren nk. autoimmunity and diabetes［j］. j clin endocrinol metab. 1999, 84: 4371.

　　［9］djordjevic vb: free radicals in cell biology［j］. int rev cytol，2004, 237:57.

　　［10］jakus v, rietbrock n. advanced glycation end-products and the progress of diabetic vascular complications［j］. physiol res，2004, 53:131.

　　［11］koya d, hayashi k, kitada m, et al. effects of antioxidants in diabetes-induced oxidative stress in glomeruli of diabetic rats［j］. j am soc，nephrol 2003, 14(suppl 3): s250.

　　［12］sanvitof, herrerapl, hurate j,et al. tgf-β1 influences the relative development of the exocrine and endocrine pancreas in vitro［j］. development 1994, 120: 3451.

　　［13］harmon eb, apelqvist aa, smart ng, et al. gdf11 modulates ngn3+ islet progenitor cell mumber and promotes β-cell differentiation in oancreas development［j］. development 2004,131: 6163.

　　［14］smart ng, apelqvist aa, gu xy, et al. conditional expression of smad7 in pancreatic β-cells disrupts tgf-β signaling and induces reversible diabetes mellitus［j］. plos biol，2006, 4(2): e39.

　　［15］leask a, abraham dj. tgf- signaling and the fibrotic response［j］. faseb j 2004, 18: 816.

　　［16］ziyadeh fn. mediators of diabetic renal disease: the case for tgf- as the major mediator［j］. j am soc nephrol 2004,15(suppl 1): s55.

　　［17］陈 蔚, 俞茂华. 以基因芯片技术研究黄芪多糖对nod小鼠胰岛基因表达的影响［j］. 中华内分泌杂志, 2004, 20（6）: 545.