作者：芦锰，贺海花，杨云，张寒娟

【摘要】  　　目的建立茯苓饮片的指纹图谱。方法采用高效液相色谱法测定，乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脱，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，紫外检测波长：242 nm。结果茯苓饮片中有11个共有峰被确定为指纹峰，采用“chromafinger v0.9 beta”软件评价12批茯苓饮片指纹图谱的相似性，相关系数法大于0.840 3，夹角余弦法大于0.906 8。结论该方法简便，稳定，精密度高，重复性好，可用于茯苓饮片的鉴别，能够有效控制饮片质量。　

【关键词】  茯苓饮片； 高效液相色谱法； 指纹图谱

　　abstract：objectiveto establish hplc fingerprint of poria cocos herbs.methodshplc was conducted and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid-water was eluted in gradient elution.the flow rate was 1.0 ml/min. the column temperature was at 30℃ and the detection wavelength was 242nm.resultsthe eleven common peaks of poria cocos herbs were determined as fingerprint peaks.similarity was analyzed by chromafinger v0.9 beta fingerprint analysis software. the results showed that similarity was more than 84.03% by correlation coefficient method and similarity was more than 90.68% by cosine method. conclusionthis method is simple, stable and reproducible.it can be used to identify and effectively control quality of poria cocos herbs. 

　　key words： poria cocos herbs；  hplc；  fingerprint
   
　　茯苓为多孔菌科真菌茯苓poria cocos (schw.) wolf的干燥菌核［1］，具有利水渗湿、健脾安神之功效。Www.11665.COM主要用于小便不利、水肿；脾虚腹泻、日久不止；痰饮停溜、食欲不振；惊悸、失眠等症。对于茯苓的指纹图谱研究，段启等［2］曾对不同产地茯苓药材进行过高效液相色谱（hplc）指纹图谱研究，而对于茯苓饮片尤其是经过规范化炮制加工的饮片hplc指纹图谱研究未见相关报道。因此，本实验对规范化炮制工艺加工的茯苓饮片进行了指纹图谱研究，以期对其质量控制和评价提供有效方法［3］。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器  

　　lc-20at高效液相色谱仪（日本岛津）；大连伊利特hypersil-ods (4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱；工作站：cbm-102；检测器：spd-20a；tp 600超声波提取器（北京天鹏电子新技术有限公司）；bs210s型电子天平（北京塞多利斯公司）。

　　1.2  试剂  

　　乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为双蒸水（经0.45μm微孔滤膜滤过），其他试剂均为分析纯。

　　1.3  药材  

　　茯苓药材分别采集于宛西制药有限公司gap基地、河南商城等地共12批（样品来源及编号见表1）。按照本课题组研究的规范化炮制工艺进行浸泡、润蒸并切制成不同规格。表1  样品来源及编号（略）

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件大连伊利特hypersil-ods (4.6 mm×250 mm)高效液相色谱柱；检测器：spd-20a；工作站：cbm-102；流动相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脱（见表2）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：242 nm 。表2  流动相梯度洗脱程序（略）

　　2.2  供试品溶液的制备

　　取茯苓饮片，粉碎，过40目筛。取粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加95%乙醇25 ml，超声提取20 min，过滤，残渣加95%乙醇重复提取两次，合并滤液并挥干乙醇，用色谱甲醇定容于10 ml容量瓶中，临用前用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

　　2.3  方法学考察

　　2.3.1  精密度实验精密

　　称取编号3药材，制备供试品溶液，连续进样5次，共有峰的相对保留时间rsd<0.452%，相对峰面积rsd<2.084%，结果表明仪器精密度良好。

　　2.3.2  稳定性实验精密

　　称取编号3药材，制备供试品溶液，24 h内连续进样5次，共有峰的相对保留时间rsd<0.636%，相对峰面积rsd<1.166%，结果表明常温下茯苓药材的供试品溶液24 h内稳定性良好。

　　2.3.3  重复性实验精密

　　称取编号3药材5份，制备供试品溶液，连续进样，共有峰的相对保留时间rsd<0.454%，相对峰面积rsd<2.122%，结果表明重复性良好。

　　2.4  茯苓饮片hplc指纹图谱及技术参数

　　2.4.1  指纹图谱选择及特征峰的标定［4］

　　测定12批茯苓饮片60min内指纹图谱，获得11个共有峰，由指纹图谱可以看出10号峰峰面积积分百分比较大，分离度及峰形较好，因此选择10号峰作为参照峰，标号为s，其他特征峰依次标号为1，2，3，……，s，11。根据结果采用“chromafingerv0.9 beta ”软件建立了茯苓饮片的色谱指纹图谱共有模式和茯苓饮片色谱叠加图结果见图1～2。

　　2.4.2　茯苓饮片指纹图谱特征峰相对保留时间和相对峰面积

　　采用12批茯苓饮片的指纹图谱，选用10号峰作为参照峰，选取12批样品的共有峰共11个，计算相对保留时间和相对峰面积。结果见表3～4。表3  12批茯苓饮片共有峰相对保留时间，表4  12批茯苓饮片共有峰相对峰面积（略）。

　　2.4.3  指纹图谱相似度的计算  采用“ chromafinger v0.9 beta ”软件对12批茯苓饮片指纹图谱进行处理得到茯苓饮片相似度分析结果。  结果见表5。表5  茯苓饮片指纹图谱相似度分析结果（略）

　　3  讨论
   
　　实验中考察了超声提取的时间和溶剂，用醋酸乙酯、丙酮作为溶剂所得提取液的指纹图谱上特征峰数目较少，且峰形较差；用正丁醇、95%乙醇和甲醇作为溶剂所得提取液的指纹图谱无明显的差异，特征峰数目较多，且峰形较好，但考虑到甲醇有较大的毒性，正丁醇由于粘度大，过滤困难，故选用95%乙醇作为提取溶剂。
   
　　超声不同的时间所得供试品溶液的指纹图谱无明显差异，但超声20 min提取供试品溶液所得的指纹图谱特征峰的峰面积之和大于超声30 min，超声40 min的峰面积之和，同时考虑到提取时间较短，故选用超声时间为20 min。
   
　　从12批茯苓饮片的分析结果来看，样本整体相似度较高，其中样本11的相似度偏低，其主要原因可能是样品11来自于新疆茯苓药材，地理位置、气候、土壤等因素的差别造成茯苓药材成分的差异，从而导致炮制加工的茯苓饮片存在差异，但是差异不是很显著（相关系数法大于0.840 3，夹角余弦法大于0.906 8）。
   
　　本研究根据12批茯苓饮片检测结果，选择11个共有峰标定茯苓饮片的指纹图谱，具有良好的系统性、特征性和重现性。经过相似度评价，所选择的12批茯苓饮片的指纹图谱相似度较高，具有良好的相关性。该方法可靠、简便，可作为茯苓饮片质量控制的参考方法。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典，ⅰ部［s］.北京:化学工业出版社，2005：166.

　　［2］段启，王跃生，王少军，等.不同产地茯苓药材高效液相色谱指纹图谱的实验研究［j］.中国实验方剂学杂志，2006，12(7):11.

　　［3］任德权.中药指纹图谱质控技术的意义与作用［j］.中药材，2001，24(4):235．

　　［4］丁岗，王振中，章晨峰，等.茯苓中三萜酸类成分hplc指纹图谱的初步研究［j］.中国中药杂志，2002，10(10):27．