作者：贲永光，丘泰球，李坤平，孙爱群

【摘要】  　　目的优选黄芪总黄酮的提取工艺。方法用正交设计法探讨了影响纤维素酶法提取黄芪中总黄酮的主要因素,并确定了最佳提取工艺。结果纤维素酶法提取黄芪总黄酮的最佳工艺条件为:酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为8 mg，ph值为4.5。结论此工艺简单可行,是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。

【关键词】  纤维素酶 黄芪 总黄酮 正交设计法
　　
　　abstract：objectiveto opmtimize the extraction technics for total flavonoids from astragalus. methodsthe orthogonal design was conducted to investigate the main cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from astragalus and the best extraction technics was determined. resultsthe optimum conditions cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from astragalus were as follows: enzymolysis time 120min, hydrolysis temperature 30 ℃, enzyme volume 8mg, ph value 4.5.conclusionthis method is simple and feasible. it is an effective way for extraction of total flavonoids from astragalis.

　　key words：cellulase;   astragalus;   total flavonoids;   orthogonal design 
   
　　黄芪为豆科植物蒙古黄芪astragalus technology或膜夹黄芪astragalus membranaceus的干燥根,具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。WWw.11665.COm黄芪中的主要有效成分为多糖、皂苷和黄酮类化合物,其中黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮(calycosin ) 及其糖苷芒柄花素 (formononetin)和芒柄花苷(ononion) 等［1］ 。研究证实黄芪中的黄酮类成分具有多种药理活性,具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化、增强免疫力、抗病毒以及促进细胞增殖的作用［2～3］。
   
　　近年来，酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率。酶解过程的实质是通过酶解反应促进传质过程。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素是黄芪细胞壁的主要成分，亦是胞内黄酮等大分子溶出的主要屏障，利用纤维素酶水解细胞壁，利于胞内成分溶出［4～9］。但将纤维素酶应用于提取黄芪中总黄酮的研究鲜见报道。本实验将上海伯奥生物科技有限公司提供的绿色木酶（主要成分为纤维素酶，以下简称纤维素酶）用于黄芪总黄酮的提取，应用正交设计优化酶法提取黄芪总黄酮的工艺条件，探讨各因素对黄芪总黄酮提取率的影响，以期达到提高提取率、缩短提取时间、减少能耗和有效保存黄芪总黄酮的生物活性，并为植物酶技术在中药有效成分的提取方面的应用提供依据。

　　1  仪器与试剂

　　1.1  仪器 

　　hh-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；re-52cs旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；uv1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；ay120电子分析天平（日本岛津公司）；kh-400kdb型高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。

　　1.2  试剂 

　　乙醇（无水乙醇）；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；4%氢氧化钠；乙酸（冰醋酸）；无水乙酸钠；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:050923）, 黄芪购自广州致信中药饮片有限公司，纤维素酶 (活性单位≥15 u／mg)由上海伯奥生物科技有限公司提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  黄芪总黄酮成分提取 

　　称取纤维素酶8 mg，用ph=4.5的hac-naac缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，在30℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容,得供试品溶液。

　　2.2  黄芪总黄酮含量的测定

　　2.2.1  芦丁对照品溶液的制备 

　　准确称取于芦丁对照品10 mg, 置于50 ml 容量瓶中, 加30%的乙醇30 ml, 超声使之溶解, 冷却至室温, 并稀释至刻度, 摇匀, 得浓度为200 μg/ml 的芦丁对照品溶液, 冷藏, 备用。

　　2.2.2  吸收波长的选择  

　　对照品测定波长的确定：取对照品溶液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处为最大吸收。样品测定波长的确定：取样品的乙醇提取液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处有最大吸收。

　　2.2.3  标准曲线制备  

　　精密称取芦丁对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别至25 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，放置6 min，加入1 mol氢氧化钠溶液4 ml，分别用30%的乙醇定容，放置15 min，置比色皿中，在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度a为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：a=0.010 9c-0.001 3，r=0.999 8。浓度在0～400 μg/ml范围内与吸光值线性关系良好。

　　2.3  黄芪中总黄酮提取率的测定 

　　取黄芪中总黄酮提取液用紫外分光光度计于500nm下测出吸光度a代入以下回归方程式及下列公式，计算出黄芪中总黄酮的提取率。  提取率（%）=（c×v×10-6）w，式中v为定容体积（ml），w为黄芪药粉质量（g），c为黄芪提取液浓度（μg/ml）。

　　2.4  单因素实验及正交实验酶法提取的整个工艺分为酶解和浸提两部分，准确称取黄芪1g，加入缓冲溶液和一定比例的酶，黄芪经酶解后在相同的条件下浸提，过滤，按标准曲线方法测定吸光度。

　　2.4.1  考察酶解温度对总黄酮提取率的影响 

　　称取纤维素酶8 mg，用ph=4.5的hac-naac缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，分别在30，35，40，45，50，55℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，按标准曲线操作测定总黄酮含量。绘制单因素图见图1。由于一般纤维素酶的活性多在40～60℃较好，因此考察酶解温度为30，40，50，60，70℃对黄芪中总黄酮提取率的影响。由图1可知，在40℃以下总黄酮的提取率随温度的升高而增大，温度为40℃时，黄芪总黄酮提取率最大，随后温度进一步升高黄芪总黄酮收率逐渐减小，温度在60℃，70℃时提取率稳定，趋向一致。这是因为40℃时纤维素酶发挥最大活性，有利于黄酮类化合物的溶出，提高黄芪总黄酮提取率。而温度进一步提高，则不利于酶活力的发挥，温度过高会使酶蛋白变性失活，丧失催化能力，因而提取效果变差。

　　2.4.2　考察酶解时间对总黄酮提取率的影响  

　　称取纤维素酶8 mg，用ph=4.5的hac-naac缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45 ℃下分别处理30，60，90，120，150 min后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃下浸提1 h，过滤定容方法同上，单因素图见图2。从图2中可知，随着酶解时间的延长，总黄酮的提取率也随着提高，当酶解2 h即可达到最佳效果，在2 h之前，延长酶解时间可明显提高总黄酮提取率，但在2.5 h实验时的总黄酮的提取率仅比2 h略高，说明酶解已经基本完成，没有再增加酶解时间的必要。

　　2.4.3  考察酶用量对总黄酮提取率的影响  

　　分别称取纤维素酶4，6，8，10，12 mg，用ph=4.5的hac-naac缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下处理1 h后加入95%的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h。过滤定容方法同上，其单因素图见图3。由图3可看出，在酶用量在8 mg之前，随着酶用量的增大，总黄酮的提取率逐步提高，酶用量到8 mg之后，总黄酮的提取率上升趋势不明显。纤维素酶用量对酶解用一定的影响，在一定的酶浓度范围内，随着酶量的增加，纤维素酶解率增大。由于一定量的纤维素在一定条件下，纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，起不到酶解作用，而从经济角度考虑，酶用量也要尽可能的少。因此最佳的酶用量为8 mg。

　　2.4.4  正交实验上面讨论了各单因子的影响，但是在实际的操作中，各因素是相互交差影响的。因此，为全面考查影响因素，设计了4因素3水平正交实验，结果见表1～2。从表2的k值和极差r值可以看出，在4个影响总黄酮提取率的因素中，影响顺序为：酶解温度（b）＞酶量（c）＞酶解时间（a）。其中a3b1c3为最佳优化条件，即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，ph值为4.5。经测定，在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。比较初步优化和正交优化的结果可以看出，两者的条件基本不同。原因可能在于4个主要因素相互影响，有相互作用。表1  正交实验的因素及水平，表2  酶法提取黄芪中总黄酮的正交实验结果（略）。

　　3　讨论

    实验结果表明，酶解时间的延长、酶量的适当加大、适当的温度和ph值有利于提高黄芪有效成分提取率。各因素对总黄酮的提取率的影响大小次序先后为：酶解温度＞酶量＞酶解时间。各因素的优化工艺参数为：a3b1c3,即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，ph值为4.5。在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。如“2.4.3”项结果，在本实验参数的基础上，为了获得较高的提取率、节省酶用量，酶用量取8 mg。此工艺简单可行,是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。
   
　　纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。黄芪细胞的细胞壁主要由纤维素构成，纤维素酶可以将其水解为葡萄糖，使其内容物更容易被提取出来。纤维素酶只是破坏黄芪细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。中草药种类繁多，有效成分结构复杂。为了提高中草药有效成分的提取率，可应用酶法提取中药有效成分。随着酶技术在中草药有效成分提取方面研究的不断深入，应用纤维素酶、果胶酶以及复合酶提高中草药药用有效成分的提取率，将成为充分利用中草药资源的有效途径，酶技术必将在中药现代化进程中发挥重要作用。

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