【摘要】 目的探讨不同激素种类和配比的培养基对半夏培养物生物碱合成的影响，为提高半夏有效成分在植物体内的富集提供理论依据。方法采用氯仿提取，依据酸性染料比色法的原理，在417 nm波长下测定，并作方差分析。结果获得良好的线性关系(r=0.998 9)和回收率(100.1%)，rsd为2.3%。ms + 2.0 mg/ml naa + 0.5mg/ml kt培养基最适合半夏培养物生物碱的积累，平均高达0.980 2%，不含 2，4-d的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱明显高于含有2，4-d的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱。结论激素种类和配比对半夏组织培养物中生物碱含量的影响较大。
【关键词】 半夏; 组织培养物; 生物碱
中药半夏为天南星科多年生草本植物半夏pinellia ternate (thunb.) breit 的干燥块茎，在我国大部分地区及朝鲜半岛和日本均有分布。半夏入药首载于《神农本草经》《中国药典》2005年版收载为唯一的半夏类药材植物。半夏块茎主要含有生物碱、β-谷甾醇、多糖、半夏蛋白、氨基酸、挥发油及无机元素等多种化学成分，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效。目前市售镇咳类中药复方制剂中多含有半夏，而生物碱在众多的化学成分中具有明显的生物活性和生理功能，是中药半夏中主要有效成分之一[1]。wWW.11665.COm近年来，由于临床配方、成方制剂中原料的需求和出口的增加[2]，加上耕作技术的改变和常年采挖，半夏野生资源逐渐减少，已经多年不能满足市场需要。为了满足国内外市场对半夏的需求，给国内外市场提供优质无公害的绿色半夏药材，本研究通过探讨不同激素种类和配比的培养基对半夏培养物生物碱的合成的影响，为中药半夏生产提供理论依据。
1 材料与仪器
1.1 样品 材料来自西华师范大学生命科学学院半夏试验基地的半夏块茎，常规消毒后接种在ms培养基上，附加不同浓度的2,4-d、kt、nna，在人工气候箱中培养，培养温度25℃，培养96 d后选取生长旺盛的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎按培养基的不同配比分别收集，洗净培养基，105℃烘箱中烘4 h后于60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过60目筛置干燥器备用。
1.2 试剂 对照品盐酸麻黄碱(中国药品生物制品检定所，批号：714- 9903) ;氨水、二氯甲烷、柠檬酸钠缓冲液(ph= 6. 0) ，0. 1%溴麝香草酚蓝溶液等均为市售分析纯。
1.3 仪器 gt3c916紫外-可见分光光度计(澳大利亚gbc科学仪器有限公司);旋转式蒸发仪(上海申科电子有限公司)。
2 方法和结果[3]
2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃ 干燥至恒重的盐酸麻黄碱对照品16. 4 mg，置 250 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含盐酸麻黄碱浓度为0. 065 6 mg/ ml对照品溶液。
2.2 样品供试液的制备 精密称取样品粉末，加入12%氨水将材料搅拌至湿润，加入样品量18倍的氯仿浸泡25 h，置70℃水浴锅中回流提取5 h，过滤，残渣以10 ml氯仿分3次洗涤，合并提取液，移至50 ml容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，摇匀，精确吸取提取液2 ml置旋转式蒸发仪浓缩至干，加入ph 6. 0缓冲液5 ml，精密加入氯仿10 ml，加0. 1 %溴麝香草酚蓝溶液1 ml，充分振荡，移至60 ml分液漏斗，静置0. 5 h.，分取氯仿层，作为样品供试液。
2. 3 实验条件的选择
2.3.1 最大吸收光谱波长的选择 精密称取样品，按“2. 2”项方法制备样品供试液，并将对照品溶液和样品供试液在380～ 600 nm波长范围内进行光谱扫描，结果两者在417 nm波长处均有最大吸收值，二者的吸收峰完全相同，吸收光谱一致，故选定417 nm作为测定波长。见图1。
2.3.2 稳定性考察 精密称取样品，按“2. 2”项制备样品供试液和空白对照液，在波长417 nm处进行测定，并在室温下每隔20 min测定1次，实验结果表明供试样品液在80 min内显色稳定，rsd= 0. 3%( n= 5)。本实验只考察了80 min内供试液的显色稳定性，因80 min 内完全可以完成测定。
图1 样品和对照品的可见-紫外吸收光谱
2.3.3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0. 1，0. 3，0. 5，0. 7，0. 9 ml，分别加蒸馏水至1. 0 ml，加入5 ml ph 6. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，精密加入氯仿10 ml和0. 1 %溴麝香草酚蓝溶液1 ml充分振荡，移至60 ml分液漏斗，静置0. 5 h，分取氯仿层，制得对照品供试液。另取1 ml水，以同样方法操作，作空白对照液，在417 nm波长处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，求得回归方程为：y= 0.157 6x+ 0.024 5, r= 0. 998 9( n= 5)，表明盐酸麻黄碱在0. 39～ 3. 47 μg 范围内与吸收度呈良好的线性关系，符合beer定律。
2.4 精密度与回收率考察
2.4.1 精密度 精密吸取0. 7 ml对照品溶液，按“2. 2”项制备对照品供试液和空白对照液，在417 nm处连续测定吸收度5次，rsd= 0. 06%，表明仪器有较好的精密度。
2.4.2 回收率 取样品粉末0. 657 g左右，精密称定5份，加入盐酸麻黄碱适量，按“2. 2”项制备供试液，在417 nm波长处测定其吸收度，平均回收率为100.1% , rsd为2. 3%。
2.5 样品含量的测定 精密称取样品粉末，按“2. 2”项方法制备样品供试液及空白对照液，在417 nm波长处分别测定其吸收度和计算含量，并用spss10.0进行方差分析。结果见表1。表1 不同激素种类配比和生物碱含量的测定结果
从表1可以看出半夏培养物中生物碱含量变化较大，对生物碱含量进行方差分析表明，在不同培养基上所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎生物碱含量差异达到极显著水平(f=95.247>f0.01，其显著性概率sig.=0.000<0.01)，经duncan多重比较，不同生长素类和细胞分裂素类浓度配比的培养基对培养物生物碱含量影响较大，与对照相比均达到显著，就每种浓度配比的培养基对培养物的生物碱合成影响大小来说，30号培养基有助于培养物生物碱的合成，生物碱的平均含量达0.980 2%，其次是22号培养基，其生物碱含量达到0.925 9%，仅次于30号培养基，再次是22，10，18，24，14，26，19，17，21，6，13，29，27，15，32，4，28，25，1，23，31，12，20，3，8，11，7，5，2，16号培养基，9号培养基对培养物生物碱的合成相对影响较小，其生物碱平均含量为0.383 6%，各种浓度配比的培养基上所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎的生物碱含量显著高于对照，说明培养基中含有促进培养物合成生物碱的物质。
2.6 培养基成分比较研究 为了考察培养基中生长素类和细胞分裂素类对半夏培养物生物碱合成的影响，将含有生长素2，4-d的培养基和不含2，4-d的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎生物碱含量均数做配对样本t检验。检验结果相关系数r=-0.271，p=0.071>0.05，可以认为含2，4-d和不含2，4-d的培养基对诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱无相关关系。配对样本t检验双尾检验概率p=0.000<0.01，故可认为含2，4-d和不含2，4-d的培养基对诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱之间存在显著差异，不含 2，4-d的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱明显高于含有2，4-d的培养基所诱导的愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎所产生的生物碱，说明2，4-d可能抑制生物碱的合成。
3 讨论
32种不同激素种类和配比的培养基对半夏组织培养物中生物碱含量的影响较大，ms+2.0 mg/ml naa+0.5 mg/ml kt的培养基对半夏培养物生物碱的合成有明显的促进作用。在组织培养过程中，不同配比的生长素和细胞分裂素的培养基所诱导的半夏愈伤组织和分化出的不定芽、不定根、再生块茎的生物碱的含量主要受到外源激素的种类和浓度的影响[1]。高浓度的naa和低浓度的kt配比效果显著，2，4-d作用明显较低，说明2，4-d抑制生物碱合成。赵剑等[4]在诱导长春花愈伤组织的过程中使用不同种类和水平的激素对生物碱的合成影响研究中也发现2，4-d显著抑制生物碱合成。
在具有不定根、不定芽和再生块茎多种分化形态的半夏组织培养物中，生物碱含量是栽培半夏的6.55 倍，说明器官分化对于组织培养物中生物碱的积累有明显的促进作用。这可能因为细胞的成团和分化往往是生物碱产生的基本条件[4]，多个细胞紧密结合成细胞小团，若干个细胞小团聚集为相对疏松的大细胞团，这种疏松的细胞体系有利于生物碱的形成，这可能是由于细胞与细胞之间的信号传递与细胞团块大小有关。此外细胞培养继代周期和接种量也可能是影响生物碱形成的重要因子[5]。
【参考文献】
[1] 曾建红,彭正松,宋经元,等. 半夏总生物碱含量的动态变化[j]. 中药材,2004，27(7):471.
[2] 毛子成,彭下松. 半夏快速繁殖体系的研究进展[j]. 中国中药杂志，2003,28(3):246.
[3] 曾建红,彭正松,陈 旭,等. 半夏块茎不同粒茎总生物碱含量的研究[j]. 时珍国医国药, 2008,19(4):829 .
[4] 赵 剑,朱蔚华,胡 秋,等. 长春花叶片中愈伤组织诱导及培养过程中生物碱合成类型的变化调节及有关酶的分析[j]. 中草药, 1999,30(7):533.
[5] 李玉峰,颜 钫,唐 琳,等. 浓密贝母的组织培养条件及不同时期生物碱积累的研究[j]. 中草药,2002,33(5):458.
