作者：马小娟， 颉东升， 何国梁
【摘要】 目的观察加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤的保护作用以阐明其药效和药物作用机理。方法采用卡介苗(bcg)+脂多糖(lps)诱导小鼠免疫性肝损伤模型，观察本方对肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(alt)及谷草转氨酶(ast)活性，脾、肝脏器系数，肝脏病理组织学损伤程度的影响，并检测小鼠肝组织匀浆丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)的含量，血清一氧化氮(no)含量及肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量。结果加味茵陈五苓散和阳性对照药物五酯片均能显著降低bcg/lps免疫性肝损伤小鼠血清中升高的alt、ast水平;且加味茵陈五苓散中剂量降酶作用优于阳性对照组;对肝脾重量的增大有显著的抑制作用;组织病理检查结果显示本品中、高剂量可减轻肝组织坏死范围及程度，减少炎细胞浸润，有明显的保肝作用。同时发现中剂量药物可显著降低肝匀浆中升高的mda水平，提高肝匀浆 sod水平，显著降低血清中升高的no含量和tnf-α含量。结论加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其直接清除自由基、降低脂质过氧化物水平、提高sod活性、减少炎性细胞因子的产生和调节机体免疫功能等有关。
【关键词】 加味茵陈五苓散; 卡介苗(bcg); 脂多糖(lps); 免疫性肝损伤
abstract：objective to study the effects of modified yinchenwulingsan on immunological liver injury in mice induced by bcg+lps and its mechanism. methodsmodified yinchenwulingsan was given to the model mice with immunological liver injury induced by bcg+lps.the samples of blood and liver were measured. the serum activities of alt and ast were analyzed, organ(1iver,spleen) immunological indexes were measured and the pathological change of hepate was observed.the content of mda and the activity of sod in liver homogenate were measured.the content of no and tnf-α in serum were measured also.resultsmodified yinchenwulingsan and wuzhi pill all could significantly decrease serum alt and ast activities of model mice ,and modified yinchenwulingsan medium dosage had better effect than wuzhipill.modified yinchenwulingsan was also found to inhibit the enlargerment of liver and spleen,reduce the putrescence of hepatic cell,decreased mda content and sod activity in liver homogenate,and reduce the levels of no and tnf-α in serum obviously.conclusionmodified yinchenwulingsan can prevent liver damage induced by bcg and lps in mice by scavenging oxygen free radical,inhibiting lipid peroxidation and regulating immune function.
key words：modified yinchenwulingsan/pharmacodynamic; bacillus of calmette-guefinvaccine; lipopolysaccharide; immune hepatic injury
加味茵陈五苓散为经方茵陈五苓散加减化裁而成，具体药物由茵陈30 g，泽泻15 g，茯苓15 g，猪苓15 g，白术15 g，白背叶根30 g，叶下珠20 g(又名：珍珠草)、黄花倒水莲15 g组成，即由茵陈五苓散去辛温之桂枝，加入近年来 治疗 肝炎临床疗效显著的中草药白背叶根、叶下珠(珍珠草)、黄花倒水莲而组成的，全方具有清热利湿，益气健脾，活血化瘀的作用，本复方临床主要用于治疗病毒性肝炎、酒精性肝炎及肝纤维化等肝病，在改善患者肝功能和临床症状方面疗效确切。www.11665.Com
现代 研究表明，免疫损害机制在病毒性肝炎尤其是乙型肝炎发病过程中起主要作用。本实验在中医理论指导下，基于以上的研究基础，以卡介苗 (bcg)+脂多糖(lps)所致免疫性肝损伤小鼠为研究对象，观察加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤的保护作用，并初步探讨该方防治肝损伤的作用机理，从而为加味茵陈五苓散治疗病毒性肝炎提供实验依据，也为该方的进一步研究打下基础。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 nih小鼠，90只，雌雄皆用，体重20～26 g，6～8周龄，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号2008a015。小鼠在恒温25～28℃，光照正常的环境中进行7 d适应性喂养后，分组进行实验。随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、加味茵陈五苓散高、中、低剂量组。
1.2 药物 加味茵陈五苓散由白背叶根30 g，茵陈30 g，泽泻15 g，茯苓15 g，猪苓15 g，白术15 g，珍珠草20 g，黄花倒水莲15 g组成(即茵陈五苓散原方去桂枝，加白背叶根、黄花倒水莲、珍珠草组成。)以上药材由广州中医药大学第一附属 医院 中药房提供;低、中、高剂量组药液每毫升含复方生药量分别为1.29 ，2.58，5.16 g;五酯片，广西方略药业有限公司生产，批号z20025766。
1.3 试剂 冻干卡介苗制剂 (calmette guerin bacillus vaccine，bcg)购自 中国 生物技术集团公司上海生物制品研究所，批号：20070901;脂多糖 (1ipopo-lysaccharide，lps)为sigma公司产品，临用前用生理盐水稀释;丙氨酸氨基转移酶 (alt)测定试剂盒 ，批号：20080506;天冬门氨酸氨基转移酶(ast)测定试剂盒，批号：20080506;丙二醛(mda)测定试剂盒，批号：20080419;超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒，批号：20080418;蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)测定试剂盒，批号：20080419;一氧化氮no测试盒(硝酸还原酶法)，批号：20080419均为南京建成生物工程研究所产品;tnf-α试剂盒为晶美公司产品，批号：20080420。
1.4 仪器与设备 tdz4-ws台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品;agilent 8453紫外分光光度计，上海分析仪器厂产品;rt-2100酶标分析仪;电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂产品。
2 方法
2.1 小鼠免疫性肝损伤造模及动物分组参照 文献 [1]，并做适当修改。取雄性nih小鼠90只，体重 20～26 g，随机分为 6组，每组15只，分别为正常对照组，免疫性肝损伤模型组 (简称模型组)，加味茵陈五苓散高、中、低剂量组和阳性对照组。模型组与治疗各组小鼠于实验1 d每只尾静脉注射bcg悬液约为2.96×107个活菌0.2ml，从造模之日起治疗组和阳性对照组开始用药：治疗低、中、高剂量组小鼠分别按人体剂量的40，20，10倍灌服25.8，51.6，103.2 g/kg加味茵陈五苓散水煎液，20 ml/kg，阳性对照组按人体剂量的10倍灌服0.46 g/kg五酯片药液，20 ml/kg，正常对照组和模型组分别灌胃等容积的生理盐水。实验的第12天，除空白组以生理盐水0.2 ml/20 g外，其他各组以lps 7 μg/20 g尾静脉注射。于静脉注射后10 h时，摘取眼球取血1ml，脱臼处死动物，并迅速取出肝脏和脾脏称重， 计算 脏器系数，以3 000 r/min离心分离血清，取肝脏左叶制备10%组织匀浆，离心后取上清测定各项指标，取肝脏右叶同一部位组织10%甲醛固定，制作石蜡切片，he染色做常规组织病理。
2.2 检测项目
2.2.1 血清酶活性测定 取分离后的血清0.2 ml，按试剂盒所述方法测定血清中的alt，ast(赖氏法)。
2.2.2 肝、脾及胸腺脏器系数测定 剖取胸腺、肝脏和脾脏，称重，计算每 10g体重的脏器重量 (胸腺指数、肝指数和脾指数)。
2.2.3 测定组织中的mda与sod水平测定 取肝脏约0.5 g，用冰冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，在冰浴盒上剪碎，用生理盐水配成10%肝组织，使用匀浆器制备肝组织匀浆，低温离心取上清液，按试剂盒说明书所述方法用紫外可见分光光度计测定肝匀浆中sod，mda含量。
2.2.4 血清no及tnf-α含量测定 取血清0.1ml按试剂盒说明书所述方法用测定血清no含量;另取血清0.1ml按试剂盒说明书所述方法检测tnf-α(elisa法)。
2.2.5 肝组织病 理学 观察 取各组小鼠肝右叶同一部位，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，he染色，光镜下观察各组肝脏组织病理变化情况。
2.3 统计学处理 计量数据均以±s表示，以t检验进行组间比较。
3 结果
3.1 小鼠一般情况及小鼠死亡率 正常对照组皮毛保持光滑亮泽，饮食正常，喜活动，体重增长正常，无1例死亡;模型对照组皮毛逐渐干枯稀疏，精神不振，体重较造模前增加不明显，进食与活动均明显减少，造模后死亡数量较多，死亡率达33.3%。加味茵陈五苓散高中低剂量组小鼠皮毛尚可，饮食及活动情况基本接近正常组，体重增加情况较正常组略低于正常组而优于模型组，死亡率分别为6.7%，6.7%和20%，低于模型组;五酯片组小鼠皮毛、饮食较正常组差，精神状态及活动情况尚可，体重增加情况好于模型组，死亡率为10.3%。
3.2 加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤小鼠血清alt，ast的影响 表1结果表明，与正常对照组相比较，模型组小鼠血清alt，ast水平均明显升高(p<0.01)，表明bcg+lps染毒后对小鼠肝细胞造成了严重的损伤;与模型组比较，加味茵陈五苓散高、中剂量组alt值显著降低(p<0.01)，高、中剂量组ast值显著降低(p<0.01)，说明加味茵陈五苓散能减少肝细胞内酶的逸出，对肝细胞有较明显的保护作用;其中中剂量组效果更为显著，低剂量组降酶作用不明显;与阳性对照组比较，低剂量组疗效不及阳性组，中、高剂量组疗效与阳性组接近，无显著性差异。表1 加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤小鼠血清alt，ast的影响 模型组与正常对照组比较，*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较，△p<0.05，△△p<0.01;各治疗组与阳性对照组比较，#p<0.05，##p<0.01
3.3 加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤小鼠脏器系数的影响 表2结果表明，模型组小鼠肝、脾系数明显高于正常对照组(p<0.01)。加味茵陈五苓散高、中剂量组均有抑制肝脾增大的作用，与模型组对比差异显著(p<0.05或p<0.01)。而低剂量组与阳性对照组未见这一作用。表2 加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤小鼠脏器系数的影响 模型组与正常对照组比较，*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较，△p<0.05，△△p<0.01;各 治疗 组与阳性组比较，#p<0.05，##p<0.01
3.4 加味茵陈五苓散对bcg+lps诱发的小鼠肝损伤组织mda含量和sod 活性的影响表3结果表明，模型组小鼠肝匀浆 mda含量明显升高(p<0.01)，sod水平明显降低(p<0.01)，高、中剂量的加味茵陈五苓散给药组和阳性对照组小鼠肝匀浆 mda含量明显低于模型组(p<0.05或p<0.01)，sod水平明显高于模型组(p<0.05或p<0.01)，其中剂量效果极为明显，但低剂量组未见明显效果。高、中剂量组与阳性对照组效果接近。表3 加味茵陈五苓散对肝损伤肝组织mda含量和sod活性的影响
模型组与正常对照组比较，*p<0.05，**p<0.01;与模型组比较，△p<0.05，△△p<0.01;各治疗组与阳性组比较，#p<0.05，##p<0.01
3.5 加味茵陈五苓散对bcg+lps所致免疫性肝损伤小鼠血清no含量和tnf-α含量的影响 表4结果表明，模型组小鼠血清中tnf-α，no水平明显高于正常对照组(p<0.01)，而加味茵陈五苓散中剂量对模型小鼠升高的no，tnf-α水平均具有明显降低作用(p<0.05或p<0.01)，低、高剂量以及阳性对照药物对no，tnf-α水平的降低作用不明显。表4 加味茵陈五苓散对肝损伤小鼠血清no水平和tnf-α水平的影响
3.6 病理观察 正常小鼠肝组织结构清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状整齐排列，未见点状坏死;肝窦枯否氏细胞未见增生(图1)。免疫性肝损伤模型组小鼠肝组织均见肝细胞索离断，其间大片肝细胞坏死消失伴大量淋巴细胞浸润，局部可见部分肝细胞内出现脂肪空泡(图2)。阳性对照组均可见再生现象，再生结节较模型组明显增多，部分肝细胞内可见少量脂肪空泡(图3)。加味茵陈五苓散低剂量组小鼠肝组织均可见肝细胞索离断、散在坏死灶，破坏程度较模型组为轻，各例均可见散在的再生肝细胞团块，排列散乱(图4)。中剂量组再生肝细胞结节较低剂量组及阳性组为多，局部可见少量细胞内脂肪空泡(图5)。高剂量组肝组织主要表现为弥漫细胞内脂肪空泡改变，部分组织可见坏死小灶及再生细胞团交错现象，再生肝细胞排列紊乱(图6)。
根据以上组织病理观察的结果，加味茵陈五苓散各剂量组均有一定疗效，低、中、高剂量组疗效比较，中剂量组肝细胞修复现象最为明显，残存的肝组织内坏死区域明显减少。中剂量组疗效优于阳性对照组，但低剂量组和高剂量组的疗效不及阳性对照组。
4 讨论
病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见疾病，对病毒性肝炎的预防和治疗问题是国内外科研工作者面临的一个重要课题。中医药治疗疾病采取辨证和辨病相结合，着眼于从整体综合调控，改善多系统的功能失调，调整机体的阴阳平衡，在治疗慢性肝病方面具有独特优势。
中医无此病名，多包括在“胁痛”“黄疸”“积聚”等疾病的病变过程中。从中医辨证施治进行探索，众多医家提出病毒性肝炎起于湿热毒邪蕴积肝胆，日久则伤及正气，影响气血运行，造成肝郁脾虚，气滞血瘀，治疗多采用清热利湿，健脾益气，理气活血为基本治法。加味茵陈五苓散由广州中医药大学何国梁教授创制，具有清热利湿、益气健脾、活血化瘀的功效，本复方在改善患者肝功能和临床症状方面疗效确切。茵陈五苓散系仲景治疗湿热黄疸的名方，临床疗效佳，广泛用于治疗各种肝胆系统疾病。方中以清利湿热的茵陈为君药，配合泽泻、猪苓、茯苓渗利水湿，白术健脾燥湿，桂枝辛温通阳化气行水。诸药合用，共奏清热解毒利湿、健脾化浊之功。 现代 药理研究表明，茵陈五苓散具有显著的护肝作用，能有效地预防和治疗大鼠酒精性肝损伤[2];茵陈作为利胆退黄的主药，它能使肝细胞坏死程度减轻，血清谷丙转氨酶活性显著下降，促进胆汁分泌，并可增加胆汁中胆酸及胆红质的排出量;茯苓、猪苓淡渗利湿，茯苓对肝损伤有保护作用，降低谷丙转氨酶活力，防止肝细胞坏死，并有免疫调节作用;白术燥湿利水，能减少肝细胞变性坏死，促进肝细胞再生，使转氨酶下降[3];白背叶根具有清热解毒、收涩消瘀之功效，有实验表明白背叶根可以显著降低丙氨酸转氨酶，抗肝纤维化，对hbsag和 hbeag病毒有明显的抑制作用[4，5];黄花倒水莲具有益气补血，健脾利湿，活血化瘀的功效。现代实验研究发现，其能够显著的抑制胆固醇与甘油三酯的吸收与合成，对小鼠急慢性肝损伤均有明显的保护作用，对生物膜脂质过氧化造成的膜结构损伤、蛋白质等物质合成代谢障碍及肝细胞坏死具保护作用，并且黄花倒水莲水煎液对乙肝病毒具有体内外抑制作用[6];叶下珠具有清热平肝、消肿解毒之功效，国内外报道叶下珠有明显的抗hbv 复制及抑hbsag，hbeag分泌的作用，对肝损伤有一定的防护作用，并且能提高机体的细胞免疫功能，改善体液免疫功能。
本实验探讨加味茵陈五苓散保肝降酶的作用，结果显示能显著降低肝细胞损伤血清升高的 alt，ast，与保肝降酶药物五酯片效果相当，甚至较优。组织病理观察的结果表明：加味茵陈五苓散中、高剂量可明显减轻肝细胞的病理性损伤，减轻肝细胞的变型，坏死及炎性细胞浸润，说明本方能够对抗 bcg/lps所致的肝损伤。
自由基与脂质过氧化作用在肝损害与肝病发生 发展 中起着重要的作用。大量动物实验证实，自由基清除系统损害是引起肝细胞损害的重要环节。多数慢性乙肝患者血清或血浆中脂质过氧化终产物mda的水平升高的同时，自由基清除剂如 sod，gsh-px，gat等严重减少或缺乏，说明慢性乙肝患者存在严重的自由基代谢紊乱。实验结果显示，免疫性肝损伤小鼠血清 mda含量明显升高，而发挥清除自由基作用的sod活性水平明显降低。同时给予加味茵陈五苓散的小鼠肝组织匀浆mda含量明显降低，而sod活性水平明显升高，说明加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤的防治机制可能与其提高机体抗脂质过氧化能力有关。
肝内免疫反应是引起肝损伤的重要机制之一，例如乙型肝炎的发病过程中，引起肝细胞损伤和破坏的直接因素是t细胞介导的细胞性免疫反应。卡介苗(bcg)和脂多糖(lps)尾静脉联合注射制造免疫性肝损伤模型，是探讨慢性肝炎免疫机制理想的模型，其病理改变和肝损伤机制与乙型病毒性肝炎相类似，近些年已被广泛采用。该模型造成肝细胞损伤是巨噬细胞(mф)介导的免疫性肝损伤，激活的 mф能释放 inf-γ、il-1以及 il-8等多种细胞因子，刺激t淋巴细胞增殖、分化，单核细胞、枯否细胞在致炎因子的作用下，向肝脏聚集并被致敏，致敏的枯否细胞在接触 lps后，会释放某些细胞毒性介质，包括氧自由基、no、tnf-α、il-1等。tnf-α不仅能直接损伤肝细胞，亦是介导肝损伤的主要介质。no既是一种弱氧化剂，具有自由基的性质，同时又是一种抗氧化剂，能够保护机体对抗一些病理性损害，no与肝损伤的关系微妙。以往许多学者对no的作用进行了研究发现，在不同条件下no具有损害和保护肝细胞的双重作用。生理浓度时，有免疫防御作用。在肝损伤时，inos活性显著增高，由其诱导并由肝内巨噬细胞及一些杀伤细胞产生的no明显增多[7]。本研究结果也显示，模型组小鼠血清中tnf-α，no较空白对照组有明显升高，两者差异有显著性意义(p<0.01)。此研究结果再次证实了t淋巴细胞活化后刺激巨噬细胞释放过多的tnf-α，no等细胞因子是免疫性肝损伤的主要病理机制。加味茵陈五苓散中、高剂量组可明显降低肝损伤动物模型血清中的tnf-α，no含量，因此加味茵陈五苓散对免疫性肝损伤的防治机制可能与调节机体免疫反应，减少tnf-α、no等细胞因子的释放有关。
【 参考 文献 】
[1] 季小梅，张秋霞，赵 晖.硝石矾石散对小鼠免疫性肝损伤模型的影响[j].
