作者：吴章怀，秦大莲，岳永花，邓莎，周淼，刘剑
【摘要】 目的研究脑舒胶囊对免疫低下小鼠免疫功能的影响。方法环磷酰胺0.02g/kg皮下注射制备免疫低下小鼠模型;碳粒廓清法观察小鼠单核巨噬细胞吞噬功能;溶血素抗体测定法观察小鼠溶血素抗体生成;足垫增厚法观察小鼠迟发型超敏反应。结果1.33g/kg脑舒胶囊能提高免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能;0.67g/kg和1.33g/kg脑舒胶囊能增加免疫低下小鼠溶血素抗体生成，并拮抗环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠足垫肿胀度减轻。但两剂量组间无明显量效关系。结论脑舒胶囊在一定程度上能改善环磷酰胺所致小鼠免疫低下的非特异性免疫功能，增加其特异性细胞免疫和体液免疫功能。
【关键词】 脑舒胶囊; 小鼠; 免疫低下; 免疫功能
abstract：objectiveto study the effect of naoshu capsule on immune function of immune deficit mice. methodsimmune deficit mouse model was made with 0.02g/kg cyclophosphamide by subcutaneous injections. the phagocytic activity of monocytes ,the haemolysin antibody formation and the delayed hypersensitivity reaction in mice were observed by means of carbon particle clearance ,haemolysin antibodies and foot pad thickening test,respectively.resultsin the immune deficit mice ,1.33g/kg naoshu capsule could enhance the phagocytic activity of monocytes, 0.67g/kg and 1.33g/kg naoshu capsule could increase content of haemolysin antibody,and decrease footpad swelling induced by cyclophosphamide.but, there is no obvious dose-effect relationship between 0.67g/kg and 1.33g/kg naoshu capsule therapeutic groups. conclusionnaoshu capsule can improve non-specific immunity,and enhance specific cellular immunity and humoral immune function in immune deficit mice induced by cyclophosphamide.
key words： naoshu capsule; mouse; immune deficit; immune function
脑舒胶囊(naoshu capsule)由我院多年用于“痴症”的验方经加工制成。wWw.11665.com研究结果显示，脑舒胶囊可明显改善aβ25-35诱导的大鼠阿尔茨海默病(alzheimers disease, ad)的学习记忆功能。近年研究发现，ad患者脑内存在严重的免疫炎症反应[1,2]。而人参、黄精、葛根等均有免疫调节作用，因此认为，由人参、黄精、葛根等组成的脑舒胶囊改善ad大鼠学习记忆能力可能与其免疫调节作用有关。本文以环磷酰胺(cyclophosphamide，cy)皮下注射制备免疫低下小鼠模型，观察脑舒胶囊对免疫低下小鼠免疫功能的影响。
1 材料
1.1 动物昆明种小鼠，雄性，体重20～22 g;豚鼠，雄性，体重400～450 g，川实动证第07-16号(240115)，泸州医学院实验动物科提供。
1.2 药物与主要试剂脑舒胶囊(naoshu capsule)，0.5g/粒，含原生药 2.875g/粒，批号070403，泸州医学院药研所提供;环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司产品;盐酸左旋咪唑片(levamisole，lms)，广东邦民制药厂有限公司生产;印度墨汁，北京西中化工厂产品，用ns稀释，ns与墨汁的体积比为5∶1，经超声波发生器处理2 min，3 000r/min转速离心15 min，取上清液;alsever's溶液的配置，枸橼酸三钠·2h2o 8.0 g，枸椽酸0.5 g，无水葡萄糖18.7 g，氯化钠4.2 g，蒸馏水加至1 l，过滤，10磅高压灭菌20 min，4℃冰箱保存备用。
2 方法
2.1 脑舒胶囊对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响参照小鼠碳粒廓清法[3]，取小鼠60只,随机分为6组，分别为空白对照组、环磷酰胺模型组、lms阳性对照组(lms 0.025 g/kg组)和脑舒胶囊低、中、高(0.67，1.33，2.33 g/kg)3个剂量组，每组10只。适应环境3 d后开始腹腔注射给药，1 次/d ,连续10 d，空白对照组和环磷酰胺模型组给予等容量生理盐水，用药组给予等容积不等浓度的不同药液。第6～8天环磷酰胺模型组和用药组皮下注射环磷酰胺0.02 g/kg复制免疫低下小鼠模型，空白对照组皮下注射等体积生理盐水。末次给药后1 h尾静脉注射印度墨汁稀释液10 ml/kg，注射后1 min(t1)及5 min(t2)分别从眼眶静脉丛取血20μl，溶于3 ml 0.1%的na2co3溶液中摇匀，用722-分光光度计于680 nm波长测吸光度(a1，a2)，以0. 1 %na2co3 溶液作空白对照。最后将小鼠脱颈椎处死，分别取肝、脾称湿重， 计算 廓清指数(clearance index, k)，然后按体重和肝、脾重量校正k值,计算吞噬系数α。k= (iga1-iga2)/(t2-t1)，α=k1/3×体重/(肝重+脾重)[4]。
2.2 小鼠溶血素抗体生成实验 采用鸡红细胞作免疫原溶血素抗体测定法(比色法) [5]，取雄性昆明种小鼠60 只，分组、给药同“2.1”项。各组于给药的第2天腹腔注射75%鸡红细胞(crbc)混悬液0.2 ml进行免疫。1 h 后，除空白对照组外，其余各组小鼠皮下注射环磷酰胺0.02 g/kg复制免疫低下小鼠模型。免疫7 d 后摘眼球取血1ml，静置过夜，4℃ 以3 500 r/min转速离心15 min，分离血清，取血清用生理盐水稀释100 倍(血清50μl稀释至5ml)，再取稀释血清2 ml加入5%crbc混悬液1 ml，置冰浴中,每管加入1 ml10%豚鼠血清,随即移至37 ℃恒温水浴中,保温30 mim，然后放入0℃冰箱中止反应，2 000 r/min 离心10 min ,取上清1 ml ,放置10 min 后,用分光光度计在540 nm处比色，测定各样品的od值，另设不加血清的空白对照 。
2.3 鸡红细胞诱发小鼠迟发性超敏反应(dth)实验根据 文献 [5]，采用足垫增厚法，取小鼠60只，分组、给药方法、模型复制同“2.1”项。给药的第2天，于各组小鼠左侧足垫皮下注射10%crbc悬液0.05ml致敏。于给药的第8天末次给药前30 min右侧足垫皮下柱射5%crbc悬液0.05 ml攻击，末次给药后24 h将小鼠脱颈处死，用外径千分尺分别测量双足足垫厚度，计算24 h足垫肿胀度。肿胀度=右侧足垫-左侧足垫。
3 结果
3.1 脑舒胶囊对免疫低下小鼠碳粒廓清的影响与对照组比较，模型组小鼠碳粒廓清指数k值明显降低(p<0.05);与模型组比较，1.33g/kg脑舒胶囊组和左旋咪唑组均有增加小鼠碳粒廓清指数k值的作用(p<0.05)，但吞噬系数α各组间无统计学意义。结果见表1。表1 各组小鼠廓清指数k及吞噬指数空白对照组比较，▲p<0.05;与环磷酰胺模型组比较，*p<0.05;n=10
3.2 脑舒胶囊对免疫低下小鼠血清溶血素的影响与空白对照组比较，环磷酰胺模型组小鼠血清溶血素抗体的od值明显降低(p<0.05);与环磷酰胺模型组比较，脑舒胶囊0.67 g/kg和1.33 g/kg组均可明显提高免疫低下小鼠的血清溶血素抗体的od值(p<0.01)，但量-效关系不明显 。结果见表2。 表2 各组小鼠血清溶血素抗体的od值与空白对照组比较，▲p<0.05;与环磷酰胺模型组比较，**p<0.01;n=10
3.3 脑舒胶囊对免疫低下小鼠迟发性超敏反应的影响与空白对照组比较，环磷酰胺模型组足垫厚度差明显降低(p<0.05);与环磷酰胺模型组比较，脑舒胶囊0.67 g/kg组和1.33 g/kg组可明显拮抗cy诱导的免疫低下小鼠足垫肿胀度减轻(p<0.05)。但量效关系不明显。结果见表3。
4 讨论
现认为免疫炎症损伤在ad发病过程中起重要作用。我们另外的实验研究了脑舒胶囊的抗炎作用及其对ad大鼠海马免疫炎性因子il-1β和il-6表达的影响，结果均显示，脑舒胶囊不仅具有较好抗炎作用，且可明显减轻ad大鼠海马il-1β和il-6表达。而衰老免疫学说又认为，在衰老过程中免疫系统的功能随之衰退[6]，因此，本文采用环磷酰胺复制小鼠免疫低下模型，以此观察脑舒胶囊对机体免疫系统的作用和免疫功能的影响，了解脑舒胶囊改善ad大鼠学习记忆能力的作用是否与其增强免疫功能有关。表3 脑舒胶囊对免疫低下小鼠迟发性超敏反应的影响与空白对照组比较，▲p<0.05;与环磷酰胺模型组比较，*p<0.05，**p<0.01;n=10
本研究建立的免疫低下小鼠模型与对照组比较,各项指标均具有统计学意义(p<0.05) ,说明模型复制成功。而碳粒廓清法测小鼠单核巨噬细胞吞噬功能、溶血素抗体法测小鼠溶血素抗体生成、足垫增厚法测脑舒胶囊对鸡红细胞致小鼠迟发型超敏反应的影响，分别观察是机体非特异性免疫功能和特异性体液免疫、细胞免疫功能常用的药理实验方法。本研究结果表明,在碳粒廓清实验中，1.33 g/kg脑舒胶囊能提高廓清指数k值 ,说明脑舒胶囊对网状内皮系统吞噬功能具有一定的激活、增强作用，提示脑舒胶囊对小鼠非特异性免疫功能具有增强作用。在小鼠溶血素抗体生成实验和小鼠迟发型超敏反应实验中，0.67 g/kg和1.33 g/kg脑舒胶囊不仅可明显改善环磷酰胺所致的小鼠血清溶血素含量降低现象,促进小鼠溶血素抗体生成，对环磷酰胺所致免疫抑制有拮抗作用;亦可拮抗环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠足垫肿胀度减轻。提示：脑舒胶囊对免疫低下小鼠的特异性体液免疫和细胞免疫功能,具有较好的免疫功能增强作用。但脑舒胶囊各剂量组间无明显量效关系，且大剂量(2.66 g/kg)脑舒胶囊对环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能与模型组比较无差异。这个结果提示，使用脑舒胶囊从调节机体免疫功能角度防治ad,必须找到一个最适剂量才能达到较为理想的防治目的。
【 参考 文献 】
[1] akiyama h, barger s, barnums, et al. inflammation and alzheimer's disease[j]. neurobiol aging, 2000, 21(3): 383.
[2] golde te. inflammation takes on alzheimer disease[j]. nat med，2002,8(9): 936.
[3] 陈 奇.中药药理研究方法学[m] . 北京: 人民卫生出版社,1993：757.
[4] 薛 彬,雷志明.免疫毒 理学 实验技术，第19版[m].北京:北京医科大学
