作者:李齐激,邹娟,王冲,潘炉台
【摘要】 目的采用高效液相色谱(hplc)法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。方法采用zorbax sb-c18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:0.02mol·l-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8),检测波长:310 nm。结果石杉碱甲在0.015~0.048 μg之间与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 95),平均回收率为99.63%,rsd为0.56%。结论首次对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定,该方法易行、灵敏、准确。
【关键词】 昆明石杉 石杉碱甲 高效液相色谱
昆明石杉huperzia kunmingensis ching.系石杉科石杉属植物,为我国特有种,主要分布于云南、贵州等地,生于灌木下、苔藓丛中[1]。20世纪80年代,我国 科学 工作者从同属植物蛇足石杉中分离到石杉碱甲(hup-a),并阐明它是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂,对 治疗 重症肌无力、记忆力减退和早老年痴呆具有较好的效果[2,3],现已被广泛应用于临床。WwW.11665.CoM为了科学、合理地利用石杉属植物资源,本实验首次采用hplc法对昆明石杉中石杉碱甲的含量进行测定,为寻找和筛选石杉碱甲新的植物资源提供科学依据。
1 仪器与试药
aigent 1100型hplc色谱仪(带四元泵,自动进样器,紫外检测器等); 电子 分析天平(日本岛津);kq50b超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电热恒温水浴锅(上海医疗器械厂);石杉碱甲对照品( 中国 药品生物制品检定所,批号:100243-200401);乙腈(色谱纯);二次重蒸水;其他试剂均为分析纯。
实验药材采至贵州黔东南,由贵州科学院生物研究所王培善教授鉴定为昆明石杉h. kunmingensis ching.,标本存放于贵阳中医学院民族医药研究所,标本凭证(20056)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件zorbax sb-c18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相0.02 mol·l-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8),检测波长为310 nm,流速1 ml·min-1,柱温25℃,进样量为5μl。在此色谱条件下,样品中的石杉碱甲与其他峰能达到基线分离,其理论塔板数为4 656,对称因子为0.92。石杉碱甲的保留时间为11.15 min,对照品与样品的色谱图见图1。
2.2 样品的制备
精密称取实验药材细粉2 g于500 ml的圆底烧瓶中,每次加入200 ml石油醚提取3次,弃去滤液。滤渣再用95%的甲醇提取3次,合并滤液并回收溶剂,加入2%的酒石酸溶解,用氨水调节ph值至8.0,再用氯仿萃取至dragendorffor' s反应呈阴性,挥干有机溶剂,用无水乙醇溶解并定容至25ml即得。
2.3 线性关系的考察
精密称取石杉碱甲对照品2.40 mg于25 ml容量瓶中以无水乙醇溶解并定容,得浓度为0.096 mg·ml-1对照品溶液,再分别稀释成0.096,0.048,0.024,0.012,0.006,0.003 mg·ml-1的对照品供试液,在色谱条件下测定。以进样浓度对峰面积进行回归,得方程:y=6 776.015 1x + 1.030 5,r=0.999 95。可知石杉碱甲在0.015~0.48 μg之间与峰面积呈良好线性关系。
2.4 精密度实验 取石杉碱甲对照溶液,在色谱条件下重复进样6次,结果石杉碱甲峰面积的rsd为0.36%(n=6)。
2.5 稳定性实验取供试品溶液,每隔2 h测定1次,考察石杉碱甲的含量变化,结果含量的rsd为0.85%(n=6),表明供试品在10 h内稳定。
2.6 重复性实验精密称样品6份,按“2.2”项的要求制备6份供试液,在色谱条件下分别进行测定,结果hup-a含量的rsd为0.60%(n=6)。
2.7 回收率实验精密称取昆明石杉药材细粉6份,每份1 g,分别加入对照品供试液(0.003 mg·ml-1)100 ml,按样品制备方法和色谱条件,制备加样回收供试液进行测定, 计算 回收率(见表1)。结果石杉碱甲的平均回收率为99.63%,rsd=0.56%(n=6)。表1 石杉碱甲加样回收率实验结果(略)
2.8 样品的测定
按“2.2”项的要求精密称取样品3份,制备供试液,按色谱条件进行测定,重复3次,取平均值,石杉碱甲在原植物中的平均含量为0.03%。
3 讨论
首次采用hplc法测定昆明石杉中石杉碱甲的含量。
测定方法是在其它石杉中石杉碱甲含量测定[4,5]方法的基础上,改用zorbax sb-c18色谱柱及以0.02 mol·l-1磷酸二氢钾-乙腈(92∶8)为流动相。实验证明该方法易行、灵敏、准确、可靠。
在同科属植物中,昆明石杉是石杉碱甲含量相对较高的一个植物品种,达到0.03%。
【 参考 文献 】
[1]王培善,王筱英.贵州蕨类植物志[m].贵阳:贵州科技出版社,2001:12.
[2]liu j s,zhu y l.the structure of hup a and b,tow new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity[j].can j chen,1986,64:837.
[3]唐希灿.石杉碱甲——一种有望 治疗 早老年痴呆症的药物[j].