作者：阳冬辉，李怡芳，姚楠，何蓉蓉，栗原博
【摘要】 目的 研究肌肽对应激负荷小鼠糖代谢的影响。方法 将雄性km小鼠分为正常对照组、应激对照组、150 mg/kg及300 mg/kg肌肽给药组，每天灌胃给药1次,连续给药7 d后拘束负荷应激20 h灌胃葡萄糖2 g/kg，检测血糖清除率、肝糖原合成能力、糖原合成酶基因表达及皮质酮水平。结果 与应激负荷对照组比较，肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率，促进糖原合成酶的基因表达，并增强肝糖原合成能力。此外，肌肽还能降低血浆皮质酮的水平。结论 肌肽增强应激负荷小鼠肝糖原合成能力，其作用机制可能与肌肽降低体内糖皮质激素水平、激活糖原合酶有关。
【关键词】 肌肽;拘束应激;肝糖原;糖皮质激素
abstract:objective to study the effect of carnosine on glycometabolism in restraintstressed mice. methods male km mice were randomized into normal control group,stress control group,150 and 300 mg/kg carnosine groups,which were intragastrically administered once a day consecutively for 7 days,and then intragastrically administered with glucose at 2 g/kg restraint stress for 20 hours; the glucose elimination rate,hepatic glycogen synthesis,gene expression of glycogen synthetase,and corticosterone level were determined.results compared with the control group,carnosine accelerated the basic glucose metabolism,upregulated the mrna expression of glycogen synthase,elevated the liver glycogen synthesis in restraintstressed mice. and it also reduced the plasma corticosterone level.conclusion carnosine could improve hepatic glycogen synthesis in restraintstressed mice. the mechanism might be related to the degression of glucocorticoids and the activation of glycogen synthase.
key words:carnosine; restraint stress; liver glycogen; glucocorticoids
近年来随着社会环境及生活方式的改变，生活及工作的压力越来越大，由各种应激源导致的亚健康状态人数也逐年增多。wWW.11665.cOm人们长期处于应激负荷状态下容易导致免疫力下降，导致各种疾病的发生。肌肽是一种具备高效生物活性的天然二肽，广泛存在于哺乳动物的肌肉组织和神经组织中[1]。研究结果表明，肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神经系统保护作用、抗糖基化作用、对肾中毒及肝损伤有一定的改善作用、可防止动脉硬化等生理活性[2,3]。但尚未见肌肽对应激负荷状态下糖代谢改善作用的报道。本实验通过观察肌肽对拘束负荷小鼠血糖浓度和肝糖原合成的影响，以及小鼠血浆中皮质酮变化，探讨肌肽对应激引起的机体糖代谢紊乱的改善作用。
1 材料与方法
1.1 试剂
肌肽(carnosine)、皮质酮(corticosterone)标准品及氢化可的松(cortisol)标准品为美国sigma公司产品;乙腈(色谱纯)为fisher scientific公司产品;乙酸乙酯和naoh为广州化学试剂厂产品;葡萄糖购自天津药业;肝糖原试剂盒购自南京建成科技公司;葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业公司;trizol购自广州英韦创津生物科技公司;逆转录系统pcr试剂盒均购自北京天根生化科技公司;pcr引物根据genbank提供的基因序列使用primer design软件进行设计，引物均由英韦创津公司合成，糖原合酶2(gy2)引物：5′aacgac agccgatgagt3′(上游)，5′ctggcacg agaaaggat3′(下游)，其扩增产物长423 bp;以18s为内参：5′gggaga gcgggtaagaga3′(上游)，5′acaggactaggc ggaaca3′(下游)，其扩增产物长241 bp。
1.2 实验仪器
高效液相色谱系统(日本hitachi公司);mk3型酶标仪(labsystem,finland);318k型台式高速冷冻离心机(德国sartorius公司);2720型pcr仪(美国applied biosystems公司);电泳成像系统(美国biorad laboratories公司);milli q plus超级纯水仪(美国millipore公司);电泳仪及水平电泳槽为日本mupid公司产品。
1.3 实验动物
体质量18～22 g，6周龄spf级雄性昆明种小鼠32只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号scxk(粤)20080002。饲养温度(23±2) ℃，照明时间12 h/d (7∶00～19∶00)，饲养1周后进行实验。
1.4 动物分组及给药
将小鼠随机分为正常对照组、拘束应激对照组、150 mg/kg及300 mg/kg肌肽给药组，共4组，每组8只。肌肽给药组以0.1 ml/10 g灌胃给药，正常对照组和拘束应激模型组均灌胃等量空白水，每日1次连续给药7 d。除正常对照组外，所有小鼠均在末次灌胃后30 min进行拘束应激实验，小鼠拘束装置参照 文献 [4]制作，为通风良好的50 ml尖底聚丙烯塑料离心管，给予一次性拘束20 h(12:00～次日8:00)，拘束期间小鼠不能进食饮水。正常对照组小鼠为禁食禁水小鼠。
1.5 小鼠糖耐受实验[5]
上述各组实验动物在禁食和拘束结束30 min后灌胃葡萄糖2 g/kg，口服葡萄糖后0、20、40、60及80 min尾静脉取血于肝素钠小离心管中，5 000 r/min 5 min离心，取血浆用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。
1.6 hplc测定小鼠血浆皮质酮的含量
取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5 000 r/min 离心5 min分离血浆。取0.5 ml 血浆，并添加入2 ml乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取1遍，合并乙酸乙酯液后用0.1 ml naoh 洗1次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入100 μl流动相(乙腈∶水=38∶72，体积比)溶解即得皮质酮分析样品溶液。按woodward等人的方法，采用hplc内标法(内标物为cortisol)测定血浆中皮质酮含量[6]。检测条件为：紫外检测，检测波长为254 nm;色谱柱：5c18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相：乙腈水(38%∶72%);流速：1 ml/min。
1.7 肝糖原合成测定
测定血糖浓度后，小鼠在乙醚麻醉下取出肝脏，按肝糖原试剂盒方法测定肝糖原含量。
1.8 半定量rtpcr检测gy2 mrna的表达
取肝脏组织，用trizol提取总rna，逆转录反应以总rna 3 μg为模板，总反应体系20 μl，42 ℃水浴1 h合成cdna。pcr反应条件设置：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸50 s，进行30次循环，最后72 ℃延伸7 min，同法以18s为内参进行pcr扩增。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳，biorad凝胶成像系统记录结果，quantity one软件进行灰度分析。结果以gy2与内参照物18s mrna扩增片段灰度值的比值表示gy2 mrna相对水平。
1.9 数据统计与分析
实验数据以(±s)表示，采用spss软件，利用anova检验进行统计学处理，p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肌肽对拘束负荷小鼠糖耐受的影响
结果见表1、图1。口服2 g/kg葡萄糖后与正常对照组相比，拘束应激小鼠的血糖浓度上升明显，在20、40和60 min时具有统计学差异。与应激对照组相比(p<0. 01)，肌肽高低剂量给药组均能使应激小鼠血糖浓度明显降低，提高糖耐受能力，结果表明肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率。表1 肌肽对拘束应激小鼠糖耐受的影响与正常对照组比较：*p<0. 05，**p<0. 01;与应激对照组比较：△p<0. 05，△△p<0. 01
2.2 肌肽对拘束负荷小鼠血浆皮质酮水平及肝糖原合成的影响
结果见表2，与正常对照组相比，拘束应激使小鼠血浆皮质酮水平显著上升(p<0.01)，肝糖原合成能力显著下降(p<0.01)。与应激对照组相比，肌肽高低剂量给药组均能降低拘束应激引起的血浆皮质酮上升(p<0.01)，促进肝糖原的合成(p<0.05)。
2.3 肌肽对拘束应激小鼠糖原合成酶表达的影响
目的基因gy2(糖原合成酶)与内参基因18s的rtpcr扩增产物的a目的基因/a内参基因能反映gy2基因的转录水平，比值越大， gy2转录水平就越高。如图2和图3所示，与正常对照组相比，拘束应激后gy2的表达明显降低，与空白对照组比较差异非常显著(p<0.01)。高低肌肽给药组gy2的表达明显升高，与拘束应激组比较差异显著(p<0.05)。表2 肌肽对拘束应激小鼠血浆皮质酮水平和肝糖原合成的影响
3 讨论
机体在应激负荷时激活交感神经肾上腺髓质系统，产生大量儿茶酚胺、兴奋性氨基酸，导致下丘脑垂体肾上腺轴(hpa)功能亢进,血液中皮质醇浓度增高[7]。糖皮质激素的释放增加，促进糖原分解和糖异生作用，抵制外周组织对葡萄糖的转运和利用，快速升高血糖[8]。实验结果表明，小鼠拘束应激20 h口服葡萄糖后血糖浓度显著升高，血糖值在20、40、60 min时显著增加。150、300 mg/ml肌肽给药能降低拘束应激小鼠血糖浓度，改善因应激负荷导致的血糖利用率低下。同时150、300 mg/ml肌肽给药能显著降低拘束应激小鼠血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成，降低糖皮质激素水平，增强葡萄糖的储备，改善了机体应激后导致的能量供应不足的状况。
糖原合酶(glycogen synthase,gys)是肝和肌肉糖原合成的关键限速酶，其中糖原合酶2(gy2)主要存在于肝脏中，调节肝糖原的合成。糖皮质激素通过调控camp和ca2+这2个信号分子，激活糖原合成酶激酶使糖原合成酶磷酸化而活性降低[9,10]。本实验结果表明150、300 mg/ml肌肽给药能够促进gy2 mrna表达，提高肝糖原合成能力，其机制可能与肌肽能显著改善机体糖皮质激素水平，激活糖原合成酶激酶，继而使糖原合成酶去磷酸化被激活有关。
肌肽作为一种新型高效天然抗氧化肽受到了国内外普遍关注，肌肽不仅具有抗氧化，抗糖基化，提高免疫力和缓解老年性疾病等作用，而且近年来肌肽药物已经开发应用于临床。本研究结果显示肌肽能显著提高拘束应激小鼠血糖利用率，降低血浆皮质酮水平，促进肝糖原合成能力及改善机体能量利用不足等作用，为肌肽的应用与开发提供一定的实验依据。
【 参考 文献 】
[1] quinn p j,boldyrev a a,formazuyd v e. carnosine: its properties,functions and potential therapeutic applications[j]. molecular aspects of medicine,1992,13 (5):379-444.
[2] 臧国雄,王辉,许素华,等. 肌肽及其生理活性研究进展[j]. 食品 科学 ,2009,30(09):272-276.
[3] 沈杰,刘超,陈钧辉. 肌肽在医药方面的研究进展[j].
