孤啡肽对大鼠脑缺血损伤后细胞凋亡的影响
【关键词】 孤啡肽;再灌注损伤;细胞凋亡;受体,谷氨酸
【摘要】 目的研究孤啡肽(ofq)对脑缺血损伤后细胞凋亡和谷氨酸受体1(glur1)表达的影响。方法成年健康雄性sprague-dawley大鼠40只，随机分为假手术组(n=8)、脑缺血组(n=8)、ofq 0.1 μg组(n=8)和ofq 1.0 μg组(n=8)、ofq 10.0 μg组(n=8)。应用longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，侧脑室微量注射ofq干预，原位tunel方法检测细胞凋亡的情况，免疫组织化学法检测glur1受体的表达。结果假手术组只有散在较少的凋亡细胞，glur1表达微弱;脑缺血组脑组织凋亡细胞增多，glur表达增强，应用ofq后凋亡细胞逐渐增多，glur表达逐渐增强。结论ofq可能通过上调glur1表达，加重脑缺血引起的氧化损伤。
【关键词】 孤啡肽;再灌注损伤;细胞凋亡;受体,谷氨酸
[abstract]objectiveto study the effect of orphanin fq (ofq) on the expression of glutamate receptor (glur) after cerebral ischemic injury in rats.methodsfourty adult healthy male sprague-dawley rats were randomly divided into sham-operation group (n=8), ischemia group (n=8), ofq 0.1 μg group (n=8), ofq 1.0 μg group (n=8), ofq 10.0 μg group(n=8). the middle cerebral artery occlusion model were established by intralumial thread method and interfered with intraventricular injection of ofq. the neuronal apoptosis was counted bu tunel assay and the expression of glur was determined by immunohistochemical assay. resultsthere were a few of neuronal apoptotic cells and weak expression of glur in sham operative group. the number of neuronal apoptotic cells and the expression of glur increased following cerebral ischemic injury. after treatment with ofq, the number of neuronal apoptotic cells and the expression of glur increased significantly than those in the ischemic group.conclusionofq could enhance the oxide injury induced with cerebral ischemia by upregulating the expression of glur.
[key words]orphanin fq; reperfusion injury; apoptosis; receptors, glutamate
业已证实，孤啡肽 fq(ofq)及其受体是一种内源性阿片肽类-受体系统，广泛存在于中枢神经系统和外周组织[1-4]，该系统能抑制细胞电活动和谷氨酸、内啡肽等递质的释放，并且有利尿、抗应激等作用。wWW.11665.cOM谷氨酸、内啡肽等在脑缺血中发挥着重要作用，因而ofq在脑缺血中也可能起着重要的作用。armstead[5]报道，ofq参与脑血液循环的调节，但是否影响脑梗死尚未见相关报道。由于谷氨酸为脑内主要兴奋性氨基酸(eaa)的一种，能通过谷氨酸受体1(glur1)，产生兴奋性毒性作用。生理状态下谷氨酸合成、分解、摄取和重吸收是一个动态平衡的过程，这种动态平衡一旦遭到破坏，引起的兴奋毒性就可能导致神经细胞的凋亡或坏死，造成广泛的脑组织病理性损害。本实验旨在研究ofq对脑缺血再灌注后glur1表达的影响，探讨其在脑缺血损伤中的作用。现将结果报告如下。
1材料和方法
1.1实验动物
雄性sprague-dawley大鼠(中国科学院实验动物中心提供)40只，体质量260～280 g，清洁级。动物术前12 h禁食。随机分为假手术组(n=8)、脑缺血组(n=8)、ofq 0.1 μg组(n=8)、ofq 1.0 μg组(n=8)、ofq 10.0 μg组(n=8)。
1.2模型的建立
用文献[6]报道的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(mcao)模型，2 h后抽出尼龙线，使缺血区再灌注。手术结束后，动物置于25 ℃环境下苏醒，自由饮食。假手术组手术步骤同上，但栓塞线不插入到阻塞部位。实验过程中监测脑电和肛温，室内温度保持25 ℃，手术台周围用白炽灯控制动物肛温在37~38 ℃。
1.3干预措施
缺血30 min，应用脑立体定位仪,在大鼠右侧脑室内埋入微量注射套管并固定，埋管位置为a0.5 mm，r/l 1 mm，h 4.2 mm。埋管30 min后ofq 0.1 μg组、ofq 1.0 μg组、ofq 10.0 μg组分别经内套管一次性注射ofq(美国rdi公司)10 μl，浓度分别为0.01、0.10、1.00 g/l。
1.4原位tunel染色
大鼠脑缺血再灌注24 h，应用40 g/l水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，左心室插管，经主动脉先后灌注生理盐水和40 g/l多聚甲醛，取脑，放入含50 g/l蔗糖的40 g/l多聚甲醛固定液中4 ℃过夜;再置入含300 g/l蔗糖-40 g/l多聚甲醛的固定液中至组织块沉底。用德国徕卡冷冻切片机行冠状位冷冻切片，切片厚度30 μm，每隔15张切片取1张，贴在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上晾干。按照dendend tunel细胞凋亡检测试剂盒(santa cruz公司)说明书进行操作，同时设立阳性对照(加1 mg/l dnaseⅰ)和阴性对照(不加探针)。荧光显微镜下观察有无发出异硫氰基荧光素(fitc)黄绿色荧光的凋亡细胞。每只大鼠取4张切片，高倍镜下(400倍)在皮质和纹状体区的缺血周边区随机各取4个视野计数凋亡细胞，取其均数。
1.5免疫组化染色
兔抗鼠glur抗体购自santa cruz公司，sabc免疫组化试剂盒、dab染液购于武汉博士德生物公司。严格按说明书染色步骤操作，光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加一抗，使用0.1 mol/l pbs代替，不出现阳性反应。每只大鼠取4张切片，在400倍光镜下随机观察皮质和纹状体区的缺血周边区各4个视野，leica qwin图像处理系统分析各个视野的吸光度(a)值。
1.6统计学处理
实验数据以±s表示，各时间点数据比较用anova法进行统计学处理。
2结果
2.1ofq对细胞凋亡的影响
各组之间凋亡细胞数比较，差异均有显著意义(f=122.68,q=4.40～28.79，p<0.05)。见表1。
2.2ofq对glur1表达的影响
假手术组脑组织glur1呈弱表达，脑缺血组脑组织glur1表达增强，应用ofq后glur1表达较脑缺血组显著增强，各组glur1表达与假手术组比较差异均有显著意义(f=22.30,q=7.35～12.43，p<0.05)，而且随ofq剂量的升高，glur表达有逐渐升高的趋势，ofq 10.0 μg组脑组织glur1的表达与脑缺血组比较差异有显著意义(q=5.07，p<0.05)。见表1。表1ofq对细胞凋亡和glur1表达的影响
3讨论
脑缺血时缺血中心区神经元以坏死为主，而缺血半暗带区则以神经元凋亡为主，并与缺血的严重性和时相延搁相关[7]。过去认为细胞兴奋性毒性的机制是坏死，而目前认为是兴奋性氨基酸触发的级联发应在神经元坏死中起关键作用。脑缺血时，谷氨酸过度释放或摄取障碍，大量积聚使其脑内浓度急剧升高，受体过度激活可引起神经元兴奋、溃变、死亡，产生兴奋性毒性，造成广泛的脑组织病理性损害。在正常情况下，谷氨酸在脑内的浓度约为10~20 mmol/l，其主要存在于谷氨酸能神经末梢囊泡内，末梢去极化兴奋时，通过ca2+依赖方式释放谷氨酸，释放的谷氨酸作用于其受体。生理情况下，细胞外谷氨酸浓度约为0.6 μmol/l，但病理情况下，当细胞外谷氨酸浓度达到2~5 μmol/l时，就能引起神经元的损伤[8]。柳耀泉等[9]报道，脑缺血早期经侧脑室注射痛敏孤啡肽fq可使感觉诱发电位波幅降低、恢复时间延长、脑梗死体积增大。因此，对局灶性脑缺血大鼠，拮抗兴奋性氨基酸性毒性以及抑制其受体活性，对脑缺血损伤具有防治作用。
本实验结果显示，大鼠脑缺血损伤后皮质和纹状体区出现大量的凋亡阳性细胞，伴有glur1表达增强。应用ofq后凋亡细胞较缺血组显著增多，glur1表达较缺血组增强，而且与剂量有关。这与文献报道的轻度脑缺血以细胞凋亡为主，严重脑缺血以坏死为主的结论相一致[10]。提示脑缺血再灌注过程中产生的大量氧自由基可引起细胞dna的损伤，当细胞自然修复能力不足以完成修复时，则导致损伤dna的积聚并启动细胞凋亡过程。
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