作者：杨永霞,杨生义，梁敏锋，丘翠环, 张薇,许静芬
【摘要】 目的 应用核磁共振氢谱(1h nuclear magnetic resonance,1h nmr)和主成分分析(principal component analysis,pca)方法研究乙肝后肝硬化患者血清的代谢组变化。方法 慢性乙肝患者血清20例和乙肝后肝硬化患者血清18例，采用bruker avance 500 mhz 超导核磁共振波谱仪进行检测，并运用模式识别方法分析乙肝后肝硬化患者血清代谢组变化。结果 乙肝患者和乙肝后肝硬化患者血清的代谢组具有明显的差异。肝硬化引起血清中的脂和胆碱/磷酸胆碱降低，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸以及葡萄糖的含量升高。结论 通过上述代谢物的变化可以区分乙肝和乙肝后肝硬化患者。这种基于磁共振氢谱和主成分分析的代谢组学方法可以为肝硬化的诊断提供可靠的分子水平上的代谢依据。
【关键词】 磁共振氢谱;肝硬化;代谢;主成分分析
abstract:objective 1h nuclear magnetic resonance (1h nmr) spectroscopy in conjunction with principal component analysis (pca) had been employed to characterize the metabolite composition of the serum samples from the patients with posthepatitic cirrhosis.methods 1h nmr spectra were measured for serum samples from 20 patients with chronic hepatitis b and 18 patients with posthepatitic cirrhosis,and the spectra data were analyzed by pca to reveal the metabonomic changes.results there were clear metabonomic differences between the patients with chronic hepatitis b and the patients with posthepatitic cirrhosis that could lead to decreased levels in lipids and phosphocholine/choline,and escalating levels of lactate,alanine,methionine,glutamine,creatine and glucose. conclusion the results showed that the metabolite changes of serum from the patients with posthepatitic cirrhosis were markedly different from those of the patients with chronic hepatitis b,what indicated that 1h nmrand principal component analysisbased metabonomic technique could provide an efficient tool for the diagnosis of posthepatitic cirrhosis at molecular level.
key words:proton nuclear magnetic resonance; posthepatitic cirrhosis; metabonomics; principal component analysis
核磁共振1h谱(1h nuclear magnetic resonance， 1h nmr)是研究生物样品(如生物组织/尿液/血液/组织提取液等)代谢组变化的一种很重要的手段,而且这种方法具有良好的客观性和可重复性，无需对样品进行特殊处理,可以实现对整个代谢组的同步检测。wWW.11665.COM肝硬化是影响人类健康的主要疾病之一，慢性乙肝若不能有效控制，可 发展 为肝硬化，如果能在肝硬化出现早期准确诊断，则会在很大程度上改善肝病的预后[1]。本研究采用磁共振1h谱来研究乙肝后肝硬化患者血清的代谢组特征，结合模式识别分析方法，找出肝硬化出现后代谢组的改变，评价磁共振氢谱用于乙肝后肝硬化诊断的临床应用价值。
1 材料和方法
1.1 样品收集 收集南方医科大学南方 医院 感染内科患者血清样本38例(根据临床乙肝和乙肝后肝硬化诊断标准[2]，慢性乙肝20例,乙肝后肝硬化18例)，置-80 ℃冰箱贮存备用。
1.2 样品预处理 1h nmr谱采样前，将所有血清样本解冻，在4 ℃下，10 000 g离心 10 min。取300 μl上层血清加至5 mm nmr测试管中，后加入0.2 mol/l 磷酸缓冲溶液(0.2 mol/l na2hpo40.2 mol/l nah2po4，ph=7.4)200 μl 和重水50 μl，振荡混匀。
1.3 nmr实验 nmr实验采用bruker avance 500 mhz 超导核磁共振波谱仪，实验温度为298 k。采用carrpurcellmeiboomgill (cpmg，relaxation delay90(τ180τ)nacquisition)脉冲序列，回波时间2 nτ=100 ms， 4 s延迟时间，10 khz谱宽，64 k数据点，采集次数为128。傅立叶变化前加0.3 hz 指数窗函数处理。采用topspin 2.0软件进行手动调相和基线校正。化学位移以乳酸甲基双重峰δ 1.33进行定标。
1.4 1h nmr谱的数据预处理和主成分分析 采用软件topspin 2.0对所有1h cpmg谱进行自动积分，积分区间δ0.5～9.0，积分间隔0.02 ppm。为了消除剩余水峰引起的影响，将积分区间δ 4.7～5.2的积分值设为零。此外，为了消除样本间因浓度不同而带来的分析误差，在进行主成分分析之前对各分段积分值进行归一化处理。归一化后的数值将作为原始数据导入软件simcap 10.0 (umetrics,sweden)中进行模式识别主成分分析(principal component analysis，pca)。
2 结果
2.1 乙肝后肝硬化患者血清的磁共振1h谱
图1是代表性的乙肝后肝硬化患者血清1h cpmg谱，谱峰信号的归属 参考 文献 报道[3,4]，谱中可以清楚地观察到脂和小分子代谢物，如异亮氨酸(isoleucine，0.93 ppm)、缬氨酸(valine，0.99 ppm、1.04 ppm)、乳酸(lactate，1.33 ppm、4.12 ppm)、丙氨酸(alanine，1.48 ppm)、n乙酰糖蛋白(nacetylglycoproteins，nac，2.04 ppm)、甲硫氨酸(methionine，2.13 ppm)、丙酮酸(pyruvate，2.37 ppm)、谷氨酰胺(glutamine，2.41 ppm)、肌酸(creatine，3.03 ppm)、 磷酸胆碱/胆碱(phosphocholine/choline，3.22 ppm)、肌醇(myoinositol，3.56 ppm，3.63 ppm)、葡萄糖(αglucose和βglucose，3.40～3.90 ppm，4.66 ppm，5.22 ppm)、酪氨酸(tyrosine，6.87 ppm，7.17 ppm)、组氨酸(histidine，7.02 ppm，7.73 ppm)、苯丙氨酸(phenylalanine，7.34 ppm)、甲酸盐(formate，8.45 ppm)。
2.2 pca分析
图2给出对乙肝患者(●)和乙肝后肝硬化患者(▲)血清1h cpmg谱的主成分分析结果(pc1 vs pc2，r2=72.2%)，分析结果以得分图和负载图给出。在得分图中乙肝患者与乙肝后肝硬化患者血清样本区分很明显，两类不同样本间的代谢差异可以从负载图中得到。乙肝后肝硬化患者血清中脂和胆碱/磷酸胆碱的含量是降低的，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量则是升高的。
3 讨论
磁共振氢谱是一种无创性的检测体内生化代谢改变的新方法[5],目前已经应用到多种疾病的分析中,以便更好地研究由于病变所引起的生物体的代谢变化,从而为疾病的诊断提供一种可靠的分子水平上的代谢依据。由于一张1h nmr谱中有很多代谢物信号峰，且代谢物之间存在一定的联系，所以仅仅凭借肉眼很难全部观察到这些代谢物的变化，而基于多变量的主成分(pca)分析方法，是通过对原始谱图进行降维，然后对所有样本进行分析，能够给出不同类型样本间的代谢差异。通过对乙肝和乙肝后肝硬化病人血清磁共振氢谱的pca分析表明,这两组血清的代谢组特征明显不同，与乙肝患者血清代谢组相比，乙肝后肝硬化引起患者血清中脂和胆碱/磷酸胆碱的含量降低，而乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量升高。
血清中脂类物质含量的改变在很多疾病中都有发现[6，7]，它表明肝硬化形成过程中脂代谢发生改变。胆碱是细胞膜的重要组成成分，肝硬化的产生导致血清中胆碱含量降低，这可能与肝细胞结节形成有关，与前人的研究结果类似[8]。葡萄糖的含量在乙肝后肝硬化患者血清中是升高的，这表明肝硬化形成引起血中糖代谢紊乱，糖代谢能力降低。在无氧条件下，葡萄糖会经过糖酵解过程转变成乳酸，如果人体能量代谢正常，乳酸将会被血液带至肝脏，进一步分解为水和二氧化碳并产生热量，血液中乳酸不会堆积。而肝硬化、肝细胞弥散变性会引起肝细胞内乳酸盐的专运能力降低，肝脏功能受损，造成乳酸盐堆积[9]，所以肝硬化患者血清中乳酸升高。此外，与乙肝患者血清相比，乙肝后肝硬化患者血清中的谷氨酰胺升高，提示存在体内氨代谢的紊乱。谷氨酰胺是氨的储存和运输形式，参与神经递质活动，肝细胞长期损伤导致其尿素合成障碍，血氨升高，产生更多的谷氨酰胺[1]。所以，肝硬化引起患者血中脂代谢、能量代谢和氨代谢过程的改变。
总之，基于磁共振氢谱和模式识别的代谢组学方法能够给出乙肝后肝硬化患者血清的代谢特征以及相关的代谢改变，这可以从分子水平去区分乙肝和乙肝后肝硬化，为乙肝后肝硬化的临床诊断提供可靠的分子水平上的代谢依据。
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