作者：李岩，李明 陈伟强，邝枣园，黄宁
【摘要】 目的 构建富组蛋白5(histidinerich protein5,hrp5)重组表达载体，表达并纯化hrp5蛋白，观察其抗菌作用。方法 用基因克隆的方法构建pet32ahrp5重组表达质粒，经iptg诱导表达后，用亲和层析的方法纯化hrp5融合蛋白，tricinesdspage电泳鉴定其分子量，琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果 成功构建了pet32ahrp5表达质粒并表达、纯化出hrp5融合蛋白，融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌pao1有抗菌活性。结论 hrp5是一种抗菌分子，参与了机体的天然免疫防御功能。
【关键词】 富组蛋白5;蛋白表达; 亲合层析;抗菌活性
abstract:objective to express and purify recombinant hrp5 protein and investigate its antimicrobial activity.methods the recombinant prokaryotic expressing plasmid pet32ahrp5 was constructed by gene cloning. induced by iptg,the fused protein with the histdinetagged was purified by histrap kit and identified by tricinesdspage. the antimicrobial activity of hrp5 was detected by agarose diffusion assay.results the recombinant hrp5 protein was purified by affinity chromatography and showed antibacterial effective activities against the pathogenic strains of escherichia coli 54299 and pseudomonas aeruginosa pao1.conclusion hrp5 protein is a potent antimicrobial molecule and it is involved in the defense of the innate immunity in vivo.
key words:histidinerich protein 5; protein expression; affinity chromatography; antimicrobial activity
富组蛋白(histidinerich proteins,hrps)为一组分子量为3～5 kd、分子中富含组氨酸的阳离子多肽，主要由灵长类动物腮腺和颌下腺分泌。WWw.11665.Com1984年研究者首次报道了hrps对变形链球菌、白色念珠菌有抑制生长和杀菌作用[1,2]，随后的研究显示hrps作为一组内源性抗菌肽，参与宿主非特异性免疫防御系统，与多种口腔感染性疾病密切相关。在至少由12种蛋白组成的hrps家族中，hrp1、3、5作为主要富组蛋白，其蛋白质之和占hrps总含量的85%以上。hrp5是hrp3的蛋白裂解产物，由hrp3 n末端的24个氨基酸残基组成，是hrps家族中抗菌效果最强的蛋白[3，4]。本实验利用基因克隆的方法构建了pet32ahrp5重组表达质粒，经iptg诱导后，用亲和层析的方法获得纯化的hrp5融合蛋白，并用琼脂糖弥散法抗菌实验证实重组蛋白的抗菌功能。
1 材 料
1.1 主要试剂
琼脂糖、溶菌酶、胰蛋白胨、酵母提取物、大豆培养基、过硫酸铵、tris、tricine (sigma公司);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、temed、蛋白质marker (merck公司);考马斯亮蓝r250 (上海试剂厂进口分装产品);连接试剂盒、限制性内切酶、taq酶(fermentas公司);质粒提取试剂盒、pcr纯化试剂盒(omega 公司);iptg(华美公司);引物、trizol试剂、depc及两步法rtpcr试剂盒(takara公司);histrap kit (amersham公司);致病性大肠杆菌54299、绿脓杆菌pao1、宿主菌de3及原核表达质粒pet32a均为本室保存。
1.2 主要仪器
纯水仪(millipore公司);超净工作台(苏净集团);pcr 仪(biometra公司);凝胶成相仪(amersham公司);低压色谱仪(amersham公司)。
2 方 法
2.1 hrp5分子片段的制备
腮腺组织来源于人因腮腺纤维瘤切除腮腺的正常腮腺组织部分，按说明书用trizol法提取总rna为模板，以oligod(t)18为引物逆转录合成第一链cdna。根据gene bank(登陆号：bc009791，hrp3)设计特异性引物，上游引物p1：5’ccg gga tcc gat tca cat gca aag aga ca3’,含bam hⅰ酶切位点，下游引物p2：5’ctg gag ctc atc gcc tcg atg tga atg3’。含sal ⅰ酶切位点，扩增hrp3 n末端的24个氨基酸编码序列。pcr反应条件为：95 ℃预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，53 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，进行30个循环，最后在72 ℃ 延伸10 min。pcr反应结束后，取5 μl琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行纯化。
2.2 hrp5分子的连接转化
纯化的扩增产物用bam hⅰ和sal ⅰ双酶切，然后按常规方法连接于同样双酶切的原核表达质粒pet32a载体。将连接产物转化入大肠杆菌de3，挑取阳性菌落送takara公司进行基因测序鉴定。
2.3 重组融合hrp5蛋白的分离纯化和鉴定
iptg诱导大肠杆菌de3的蛋白表达，-70 ℃/37 ℃反复冻融10次后，用超声破碎仪破菌，收集上清，经histrap kit柱亲合层析法纯化，tricinesdspage鉴定。
2.4 重组融合hrp5蛋白的抗菌作用
采用琼脂糖弥散法进行抗菌功能研究，主要步骤：制备底层含菌培养基(0.3%大豆,1%琼脂糖,10 mmol/l，ph 5. 5 的柠檬酸磷酸氢二钠，加入对数生长期细菌3×105 /ml)，旋涡震荡后倒入无菌平皿中，待凝固后在底层培养基上打直径3 mm的圆孔，每孔加入5 μl重组融合hrp5蛋白，以溶菌酶做阳性对照，37 ℃孵育3 h后，在底层含菌培养基上倒入顶层培养基(1%琼脂糖,6%大豆)，37 ℃孵育过夜。
3 结 果
3.1 重组表达质粒pet32ahrp5的鉴定
以腮腺总rna为模板，采用两步法rtpcr法，用hrp5特异性引物扩增，在低于100 bp处可见清晰的条带。将pcr产物连接到pet32a载体，用酶切法筛选阳性质粒，结果见图1。阳性质粒经进一步测序鉴定，结果与hrp3 n端24个氨基酸残基编码序列一致，说明pet32ahrp5表达载体构建成功。
3.2 融合蛋白hrp5的分离纯化
将经iptg诱导表达的上清用histrap kit亲和层析柱纯化后行tricinesdspage电泳，可见在约23 kd处有明显表达增强的条带以及经过亲和层析柱纯化后较为单一的条带，蛋白分子量大小与预期相符，结果见图2。
3.3 重组蛋白抗菌作用
重组蛋白hrp5对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌pao1有明显的抗菌作用，说明通过原核表达，获得了具有抗菌活性的hrp5蛋白，结果见图3。
4 讨 论
近年来,学者们对机体抗感染防御功能的认识取得了显著进展。其中一个主要的突破就是发现动物界普遍存在有很强抗菌活性的内源性抗菌肽(endogenous antibiotic peptides)，它是机体对抗微生物感染的关键因素[5]。目前在植物、昆虫、两栖类动物、哺乳动物中已经发现了超过100多种抗菌肽分子，它们具有较强的抗微生物活性，在维持机体的抗微生物免疫功能方面具有重要作用[6]。在人类，不仅与免疫密切相关的中性粒细胞、巨噬细胞等细胞中有抗菌活性分子的存在，上皮细胞也是抗菌分子的重要来源。目前在消化系统、呼吸系统和泌尿生殖系统等与外界相通的组织器官中都已经分离得到了多种抗菌分子，包括乳铁蛋白、溶菌酶、防御素家族蛋白和cathelicidins家族蛋白等。
唾液蛋白质是唾液的主要组成成分，它对维护口腔正常的功能和口腔组织健康及口腔微生物的动态平衡起着重要作用[7]。大量研究发现,hrps对引起口腔感染的白色念珠菌、溶血链球菌等细菌有抑菌和杀菌作用，证实hrps是一组内源性抗菌肽，在口腔对抗细菌感染和口腔感染性疾病中发挥重要作用[8,9]。国内吴琦[10]等也得到了类似的研究结果，并发现hrps对真菌、革兰阳性和阴性细菌都有抗菌作用，还可以中和革兰阴性菌分泌的内毒素，提出hrps是一种广谱的抗菌分子。罗海燕[11]等也证实了hrps对多种细菌的杀菌作用。
本实验利用原核表达质粒pet32a成功地构建、表达出融合蛋白hrp5，经histrap亲和层析柱纯化后，用琼脂糖弥散抗菌法证实此融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌pao1有抗菌作用。另外，原核表达质粒pet32a由于存在独特的硫氧还原蛋白编码基因，能增加此融合蛋白在大肠杆菌细胞质中的可溶性，同时由于该原核表达质粒所编码蛋白的n 端与c端均带有his标签，使融合蛋白更有利于被分离纯化，这些优点有利于体外制备大量的hrp5分子，以进一步研究hrp5对其他细菌的杀伤作用及其作用机制。
【 参考 文献 】
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[2] pollock j j,denepitiya l,mackay b j,et al. fungistatic and fungicidal activity of human parotid salivary histidinerich polypeptides on candida albicans [j]. infect immun,1984,44(3):702-707.
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[9] koshlukova s e,araujo m w,baev d,et al. released atp is an extracellular cytotoxic mediator in salivary histatin 5induced killing of candida albicans [j]. infect immun,2000,68(12):6848-6856.
[10] 吴琦,杨美薷,钟德钰,等. 腮腺唾液富组蛋白抗菌活性的研究[j]. 中华口腔医学杂志,1997,32(6):356-359
[11] 罗海燕,黄宁,杨美薷,等. 唾液富组蛋白的分离纯化及抗菌活性观察[j]. 华西口腔医学杂志,1999,3(17):9227-9232.
