中药复方制剂抗真菌的实验研究进展
【关键词】 中药 复方制剂 抗真菌
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近年来，随着甾体类激素、广谱抗生素的大量应用，导管插管、器官移植的不断开展，尤其是一些免疫障碍疾病如爱滋病患者的大量发生，真菌感染的情况日益多见，一些原不致病的真菌亦开始致病。据保守估计，近20年来深部真菌病患者已增加40倍[1]。随着真菌发病率的逐年上升，目前用于临床的抗真菌药物亦不断涌现，但由于抗真菌药物的严重毒副作用[2]和耐药问题的日益明显，影响了其更为广泛的应用，而中药具有副作用小、来源广、价格低廉、较少出现耐药等优点，使研究开发抗真菌中药具备良好前景。上世纪20年代开始，人们便开始从中药中寻找高效低毒的抗真菌中草药，至今已成功地筛选出许多具有抗真菌活性的中药[3～5]。但国内外学者主要研究中药有效成分和单味药的抗真菌作用，对复方涉及较少。中药抗真菌机制复杂，有些方剂中的单味药并无明显的抗真菌活性，但其复方对某些实验性动物真菌感染则有一定治疗效果[6]。上世纪90年代以来抗真菌作用的中草药复方研究正在逐渐兴起，现对抗真菌中药复方制剂的研究作一综述。wWw.11665.com
1 体外抗真菌活性
临床报道，较多的中药方剂对真菌感染性疾病显示出良好的治疗作用[7-11]。通过实验研究亦发现中药复方制剂具有良好的体外抗真菌活性。目前体外抗真菌药物敏感性试验方法主要为琼脂稀释法、琼脂扩散法及美国临床和实验室标准协会(clsi)的m27-a、m38-a方案。琼脂稀释法是目前较为广泛应用的初筛方法，其方法是在琼脂平板内掺入不同浓度的抗真菌药物，以多点接种法将相同量的待测真菌接种于琼脂表面，以菌不生长的最低浓度定为该药对真菌的最小抑菌浓度(mic)。多数研究者在试管内或在平皿内进行, 此方法适合于大量菌株测定实验。胡圣爱等[12]应用固体培养基试管内药基法测定了肤癣消搽剂(连翘、苦参、大风子、鸦胆子、黄柏、蛇床子等)对石膏样小孢子菌有抑制作用, 其mic为1:100倍。杨志波等[13]采用沙氏培养基试管内药基法观察到复方二矾浸液(枯矾、皂矾、儿茶、侧柏叶、地骨皮、土槿皮、黄精、公丁香、血竭、食醋)对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌的最小抑菌浓度分别是0.25%、0.5%、0.5%。谢淑霞等[14]采用沙氏培养基试管内药基法观察到祛癣洗剂(白藓皮、苦参、地肤子、土槿皮、羌活、紫地榆、黄柏、椒目、百部、蛇床子等)对我国南方常见的9种致病真菌均有抑制作用，其最小抑菌浓度6.25%～50%，对癣菌的抑制作用优于白念珠菌。卢全德等[15]报道采用试管内药基法测得肤疾安喷雾剂(金银花、野菊花、苦参、血竭、薄荷脑等)对絮状表皮癣菌、红色毛癣菌的mic为0.39mg/ml，对须癣毛癣菌、羊毛状小孢子菌的mic为0.78mg/ml，对白念珠菌、青霉菌为1.56 mg/ml。陈超等[16] 以琼脂稀释法观察到复方黄连皮康酊(黄连100g、苦楝皮50g、海桐皮50 、藁本30g、槟榔50g、大风子15g、郁金30g、白矾30g、芦荟30g、地肤子50g、芜荑30g 组方制成酊剂)对皮肤癣菌(红色毛癣菌、须癣毛癣菌和絮状表皮癣菌)及深部真菌(白念珠菌)均有明显的抗菌作用，使菌落缩小，与克霉唑癣药水差异有统计学意义(p<0.01)，并且得出复方黄连皮康酊对表皮真菌的抗菌作用大于对深部真菌(白念珠菌)的结论。魏蓉[17]用试管琼脂稀释法观察到祛癣止痒洗剂(丁香、黄精、龙胆草、明矾、百部、藿香、黄连、土槿皮、薄荷脑、冰片水煎液)对9种真菌均有抑制作用，抑菌浓度分别为0.39% (红色毛癣菌)、0.195%(须癣毛癣菌、断发毛癣菌、紫色毛癣菌、许兰毛癣菌、羊毛状小孢子癣菌、絮状表皮癣菌)、0.75%(石膏样小孢子菌)、1.56% (白念珠菌)。张玲等[18]采用试管稀释法，进行蟹黄肤宁软膏对犬小孢子菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、红色毛癣菌的体外药效学研究，结果蟹黄肤宁软膏对8株浅部毛癣菌属的mic均在0.03125～0.25mg/ml之间，显示了蟹黄肤宁软膏较好的体外抗真菌活性。琼脂扩散法是通过测量真菌生长被抑制的范围大小来确定抗真菌活性，也是一种简单、易行的初筛方法。杨国晶等[19]用琼脂扩散法观察了复方苦槿霜(苦参150g、土槿皮150g、黄柏150g、白藓皮150g、地肤子150g、川芎150g、儿茶100g)及其原料药对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子癣菌、白念珠菌的抑菌作用，结果10%、20%复方苦槿霜及10%、20%原料药抑菌效果相同，与达克宁相当，差异无统计学意义(p>0.05)，明显优于5%复方苦槿霜及5%原料药的抑菌效果，两组比较差异有统计学意义(p<0.05)。何定淑等[20]采用纸片浓度梯度法研究硝矾散(枯矾、芒硝)对红色毛癣菌和须癣毛癣菌株的体外抑菌作用，结果2%硝矾散对红色毛癣菌、须癣毛癣菌的mic范围分别为0.0625～0.125mg/ml、0.03125～0.125mg/ml。林静瑜等[21]采用打孔药物琼脂扩散法观察到癣药膏(由丁香、蜂房等8味中药组成)5%浓度以上对须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、红色毛癣菌均有明显的抗菌作用，1%浓度仅对须癣毛癣菌有抗菌作用，但各浓度均对白念珠菌感染无效。曾嵘等[22]采用管蝶法对玉阴洁冲洗剂进行了药效学研究，结果表明，1g生药/ml玉阴洁洗剂体外对白念珠菌有一定的抑制作用，抑菌圈为(20.0±0.8) mm，mic为12.5%(1:8稀释度)。徐文跃等[23]采用改良的平皿挖洞灌药法观察到白莲洗剂(由白头翁、半边莲、蛇床子、黄连、黄柏、百部、地肤子等组成)对白念珠菌有明显抑制作用，其作用强度与洁尔阴相当。琼脂稀释法和琼脂扩散法的试验结果受许多因素的影响，包括菌接种液的浓度及准备、培养基成分及ph值，孵育时间和温度及不同的终点判定方法等，重复性差，不利于各实验室之间的比较，美国临床和实验室标准协会(clsi)在1997年、1998年和2003年先后提出了酵母菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案(m27-a)、产孢丝状真菌的抗真菌药敏试验倡导方案(m38-p)和m38-a方案，这些方案准确性好、重复性高，实验室间结果的一致性可与抗细菌的药物敏感试验相媲美。郑玮清等[24]参照clsi m38-a液基试管法进行改良，观察甲癣中药洗剂(龙胆草40g、黄连30g、射干20g、半枝莲30g、地肤子50g、紫草10g和花椒10g)蒸馏水提取液和乙醇提取液对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、羊毛状小孢子菌、絮状表皮癣菌和白念珠菌的抗真菌作用。结果甲癣中药洗剂对皮肤癣菌的敏感性较好，而对白念珠菌的敏感性较差，同时可明显看出，醇提液的mic值低于水提液的mic值，说明中药的抗真菌药物成分不仅包括水溶性物质，而且包括脂溶性物质。尤力都孜·买买提等[25]采用clsi m-38p方案测定维药雅丽蔓制剂对临床常见皮肤癣菌的抗菌作用，结果，对须癣毛癣菌的mic90为190.46μg/ml(平均mic 128μg/ml)，对红色毛癣菌的mic 90为148.57μg/ml(平均mic 93.42μg/ml)，对絮状表皮癣菌的mic 90为311.27μg/ml(平均mic 128μg/ml)，对石膏样小孢子菌的mic90为429.54μg/ml(平均mic 194.01μg/ml)。雅丽蔓制剂对真菌中不同菌种的mic90值范围为148～429μg/ml，表明雅丽蔓制剂对临床常见皮肤癣菌具有显著的抗真菌作用。郑玮清等[26]以美国clsi m27-a液基法并在此基础上进行改良，检测硝矾洗剂(硼砂、芒硝、明矾1:1水溶液)及其单味药物对红色毛癣菌15株、须癣毛癣菌9株的mfc和mic，结果硝矾洗剂的mfc为1.25～20 mg/ml(平均为5.26mg/ml)，低于芒硝的mic和明矾的mfc值。
2 动物实验
部分学者利用动物真菌病模型进行了抗真菌中药的研究，相比仅在试管内进行抗真菌试验得到的结果应更有意义。徐洪波等[27]用红色毛癣菌制作豚鼠皮肤真菌感染模型，将25%藿黄散洗剂(藿香、黄精、苦参、茵陈、枯矾等)水煎液涂布感染皮肤，给药2次/d，连续给药21d。豚鼠在用药6d后鳞屑减少，12d后鳞屑逐渐消失，呈浅红色斑，真菌检查均为阴性，18～21d皮肤外观恢复正常。何定淑等[20]用2%和4%硝矾散温水浸泡治疗豚鼠须癣毛癣菌感染的足癣、体癣，1次/d，30min/次，共7d，显示具有较好疗效，与1%足光粉比较差异无统计学意义，与蒸馏水组比较差异有统计学意义。曾勇等[28]研究消炎抗癣霜(由升药底、蛇床子、冰片、樟脑等中药组成)对石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌导致的豚鼠体癣模型的治疗作用，结果，2周后观察到消炎抗癣霜能够减轻真菌所致豚鼠皮肤病变程度，提高真菌镜检和真菌培养的转阴率。杨小洁等[29]观察了中药真菌安胶囊对白念珠菌深部感染小鼠的治疗作用，结果治疗组、预防组深部真菌感染的小鼠病死率和血液内的真菌数，与非治疗组相比明显降低，实验表明中药真菌安胶囊有治疗白念珠菌深部感染的作用。谭元生等[30]对复方苦参液的药效学进行动物实验研究表明，复方苦参洗液具有较好的抗家兔阴道黏膜人工白念珠菌感染作用，其治疗后阴道涂片、真菌学培养、病理切片检查结果与洁尔阴组相比无差异。梁君儿等[31]制成大白兔白色念珠菌阴道炎模型，并使用香荷药条(由黄连、黄柏、丁香、薄荷等7味药组成) 治疗，实验表明香荷药条能有效抑制白色念珠菌的生长，使大白兔阴道白色念珠菌的转阴率与对照组达克宁栓无显著性差异。
3 中药复方制剂与单味药物的体外抗真菌活性比较
邱莹等[32]观察大风子、皂角、川椒、百部、蛇床子、大黄、地骨皮、黄柏、苦参、白藓皮、地肤子、红花、桃仁、姜黄、藿香、芒硝、明矾、硼砂、荆芥、防风20种中药水煎液及根据单味中药抑菌实验结果选取的6种(大风子、皂角、川椒、明矾、藿香、地骨皮)抑菌效果最好的中药组成的复方水煎液对皮肤癣菌和白念珠菌的抑菌作用，结果复方抑皮肤癣菌mic:0.625%,对白念珠菌mic:2.5%，抑菌强度好于单味药，说明这些药物之间有协同作用。郑玮清等[26]检测硝矾洗剂(硼砂、芒硝、明矾1:1水溶液)及其单味药物对红色毛癣菌和须癣毛癣菌mic，结果硝矾洗剂、硼砂、芒硝、明矾的平均mic(或mfc)分别为5.26mg/ml、2.313mg/ml、20.19 mg/ml、12.13 mg/ml，硝矾洗剂的抗真菌活性强于芒硝组和明矾组，弱于硼砂组。黄宁等[33]观察方剂1(白藓皮、生姜、大蒜、川椒、斑蟊、丁香即复方白藓皮)、方剂2为复方白藓皮的拆方(丁香、白藓皮、斑蝥、川椒)和复方白藓皮的各单味中药的醇提液对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、白念珠菌、短帚菌5种甲真菌病常见致病菌的mic，结果方剂2的抑菌效果明显优于方剂1及各单味中药(p<0.05)。作者认为这可能复方白藓皮酊中各组分药物间还存在一定相互拮抗的作用，因此拆方后表现出更优的抗真菌作用，但因部分中药抗真菌机制多样性，有的可能通过增强机体免疫力而抗真菌，故复方白藓皮酊的临床效果也很显著，这有待在临床中做进一步的研究。中药复方制剂药物之间具有相互协同、提高单味中药的抗真菌活性，或是相互拮抗、降低抗菌作用，或是中药在体内通过其他途径发挥抗真菌作用，如提高机体免疫力，这也需今后进一步的研究。
4 作用机制探讨
中草药抗真菌的机制尚不十分清楚，不少学者研究认为，中草药对真菌的作用机制主要在于破坏其细胞壁、细胞膜的完整，或影响其核酸、脂质代谢等方面。杨国晶等[19]在进行复方苦槿霜及其原料药对常见皮肤癣菌和白念珠菌的体外抑制试验时，通过电镜观察到未经药物作用的红色毛癣菌细胞菌丝体外形充盈，饱满，表面光滑，大、小分生孢子生长良好，经10%复方苦槿霜作用后的红色毛癣菌细胞超微结构改变：细胞明显变性，细胞膜皱缩，细胞浆中大部分被电子薄区占据，细胞器消失。说明复方苦槿霜具有较强的抗真菌作用，推测其可能通过抑制胞壁和胞膜成分的合成，引起菌体破裂，内容物渗出而发挥抗真菌作用。另外，近年来提出，一些反复发作的浅部及深部真菌感染，机体常伴有免疫功能的紊乱或低下，中药复方制剂可能通过提高机体免疫功能而起抗真菌作用。太加斌等[34]研究发现竹叶石膏汤能使免疫抑制状态下白念珠菌系统感染小鼠的生存时间延长，肾脏内活菌数减少, 对免疫功能正常的白念珠菌系统感染小鼠则无显著性疗效，但与氟康唑合用比单用氟康唑疗效好, 能使小鼠的存活时间延长，肾脏内的活菌数减少，即有协同氟康唑疗效的作用。通过实验认为竹叶石膏汤对深部念珠菌感染有一定的保护作用，尤其是免疫功能低下时效果更显著，与氟康唑合用能显著提高疗效，其作用可能与调节机体免疫功能有关。刘春英等[35]的研究发现，补中益气汤是良好的免疫激活剂，能显著提高抗体水平及细胞免疫功能，表现对下降的t淋巴细胞α-醋酸萘酯酶(anae)阳性率、淋巴细胞转形率、巨噬细胞fc受体活性(ea花环率)、溶血素、脾脏抗体形成细胞(pfc)具有升高作用，与未经药物治疗组比较有显著性差异。作者认为，补益类中药可促进和调节白念珠菌感染所引起的小鼠免疫功能紊乱的恢复，可作为抗真菌治疗的辅助手段。
5 问题与展望
近年来，在中药抗真菌实验研究中，主要集中在对单味中药及提取的单一成分上，有利于明确中药抗真菌的作用位点，但中药应用于临床的多为复方制剂，作用于人体的为多种成分的复合物，对复方中药制剂的研究也十分必要，特别是作用机制的研究，但与单味中药研究相比，复方中药制剂成分复杂，给抗真菌作用机制研究带来了困难。复方中药制剂抗真菌机制研究将成为今后研究的重点与难点。目前中草药的体外抗真菌活性研究多采用琼脂稀释法和琼脂扩散法，由于该方法影响因素多，实验结果不稳定，差异较大，无法进行实验室之间的比较。总结这些方法，寻找可靠、简便、易行的测定方法及实验室条件, 尽快进入标准化轨道，在寻找有体外抗真菌活性的中草药的研究中具有重要意义。
体外抗真菌试验有利于筛选具有抗真菌活性的方药，但体外抗真菌实验结果与体内差别颇大，而动物实验是检验中草药对真菌感染的疗效及了解其毒性、吸收、分布、代谢和排泄等情况不可缺少的环节。因此, 应进一步加强利用动物真菌病理模型进行体内研究。
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作者：陶茂灿 夏修蛟 曹毅 作者单位：310006 浙江省中医院(陶茂灿 曹毅) 310009 杭州市第三人民医院(夏修蛟)
