【摘要】 目的 建立以高效液相色谱法测定赤芍中丹皮酚含量的方法。方法 采用超声和回流两种方法提取赤芍药材中的丹皮酚,采用高效液相色谱法测定其含量。色谱柱为agilent zorbax sb-c18(stable bond analytical 4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(45∶55),流速为1 ml/min,柱温25 ℃,检测波长274 nm。结果 线性回归方程为：y=1.01×105x-9.84×102,r=0.999 9(n=5),在0.104～0.52 μg范围内丹皮酚的峰面积与进样量有良好的线性关系。结论 本法操作简便、准确、重复性好,可用于赤芍药材中丹皮酚含量的测定,同时可作为赤芍药材在炮制前后的质量控制方法之一。
【关键词】 赤芍;丹皮酚;高效液相色谱法;含量测定
effect of two extracting methods on content of paeonol in paeonia lactiflora pall. by hplc peng xiao-xia, zhang zhen-wei, chi dong, et al (gansu college of tcm, lanzhou 730000, china)
abstract：objective to establish a hplc method for determining the content of paeonol in paeonia lactiflora pall.. methods ultrasound and reflux methods were used to extract paeonol in paeonia lactiflora pall., and then the content of paeonol was determined by hplc. it was performed on agilent column zorbax sb-c18 (stable bond analytical 4.6 mm×250 mm, 5 μm), mobile phase was methanol-water (45∶55), flow rate was 1 ml/min, column temperature was 25 ℃, and detection wavelength was 274 nm. results the regression equation was y=1.01×105x-9.84×102, r=0.999 9 (n=5). the standard curve was linear within the range of 0.104～0.52 μg for paeonol. conclusion the method is simple and accurate with good reproducibility. it is suitable for determining the content of paeonol in paeonia lactiflora pall. and control the quality control of paeonia lactiflora pall. in process.
key words：paeonia lactiflora pall.;paeonol;hplc;content determination
赤芍为毛茛科芍药属植物芍药(paeonia lactiflora pall.)或川赤芍(paeonia veitchii lynch)的干燥根,其有效成分中含有丹皮酚[1]。WWW.11665.CoM丹皮酚易溶于乙醇和甲醇,可溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳,稍溶于水,在热水中溶解,不溶于冷水,能随水蒸气挥发,呈白色针状结晶,具有熔点低、易挥发及水溶性差的特性[2]。研究表明,丹皮酚具有镇静、镇痛、解热、解痉、抗炎等作用,并具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、改善微循环、保护缺血组织、抗菌和抑制皮肤色素合成等作用。近年来还发现丹皮酚具有抗肿瘤作用,同时能提高机体免疫力且无明显不良反应。丹皮酚的提取方法主要有醇提法、水蒸气蒸馏法、co2超临界流体萃取法等[3]。本试验依据2005年版《中华人民共和国药典》牡丹皮和徐长卿中丹皮酚的测定方法,采用超声提取,依据有关报道采用乙醇回流提取[4-5],以高效液相色谱法(hplc)测定其含量,并对比两种不同方法提取对其含量的影响,通过建立赤芍中丹皮酚的含量测定方法,多角度控制赤芍药材的质量。
1 仪器与试药
waters 600高效液相色谱仪(waters 600泵,waters 2487双波长检测器,waters empower色谱工作站);超声清洗仪(200 w,50 hz,天津奥特赛恩斯仪器有限公司as7240b);混合纤维素酯微孔滤膜(孔径：0.45 μm);聚偏氟乙烯微孔滤膜(f型,孔径：0.45 μm);电子分析天平(sartorius bs 224 s);超级恒温水浴(dkb-50常州荣冠实验分析仪器厂)。
丹皮酚对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110708-200505,供含量测定使用);药材赤芍(购于甘肃中医学院附属医院)经中药鉴定教研室主任杨扶德教授鉴定为毛茛科植物芍药paeonia lactiflora pall.的干燥根。甲醇(色谱纯,山东禹王,批号20070315112),乙醇(分析纯,批号20070827093),水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
agilent zorbax sb-c18(stable bond analytical 4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;流动相：甲醇-水(45∶55);流速：1 ml/min;柱温25 ℃;检测波长274 nm。在此色谱条件下,理论塔板数大于13 000,分离度大于1.5。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取丹皮酚对照品2.6 mg置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得每1 ml对照品溶液含丹皮酚104 μg。
2.3 供试品溶液的制备
取样品粗粉(过40目)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,密塞,摇匀,称定重量,超声处理(功率200 w,频率50 hz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过。精密取续滤液1 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀即得,备用。
取样品粗粉(过40目)约1.0 g,精密称定,置圆底烧瓶中,加入8倍量75%乙醇,于80 ℃回流30 min,低温挥干乙醇,加甲醇溶解,精密取续滤液1 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀即得,备用。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下的丹皮酚对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml置10 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀即得,制成一系列浓度的对照品标准溶液。分别精密吸取20 μl进样,注入液相色谱仪,记录色谱,以峰面积为纵坐标,丹皮酚浓度为横坐标进行回归计算,得线性回归方程为：y=1.01×105x-9.84×102,r=0.999 9(n=5),结果表明,在0.104～0.52 μg范围内丹皮酚的峰面积与进样量呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液(104 μg/ml)20 μl,重复进样5次,并进行测定,测定其rsd=0.75%,表明精密度良好。
2.6 稳定性试验
按“2.3”项下方法制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液20 μl,分别于0、4、8、16、24 h进样,测定其rsd=0.83%(n=5),结果表明,供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验
按“2.3”项下方法制备供试品溶液5份,精密吸取供试品溶液20 μl进行测定,丹皮酚平均含量为6.705 μg/g,rsd=0.91%(n=5),说明供试品溶液重复性良好。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知丹皮酚含量的供试品1 g,每3份为一组,加入对照品溶液,分别精密加入5.2 μg/ml对照品溶液0.5、1.0 ml,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,并进行测定,记录色谱,计算其rsd=0.81%,表明回收率符合规定。结果见表1。表1 加样回收率试验结果(n=6)
2.9 丹皮酚的含量测定
按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别进样20 μl,测定(n=3),取3次测定平均值。结果见表2,色谱图见图1。
由表2可知,采用甲醇超声提取得到丹皮酚的含量普遍偏高,采用75%乙醇回流得到的含量较低。由于采用回流提取时用到的乙醇溶剂较少,在回流时随着时间延长,乙醇不断挥发,故给药材成分提取带来损失,有可能使提取量较少。表2 不同提取方法的赤芍中丹皮酚含量测定结果
3 讨论
赤芍中主要有效成分为芍药苷,本试验选取其含量较低的丹皮酚作为参考指标,目的是对赤芍中丹皮酚做一定量,以达到综合控制赤芍药材质量的目的。
本试验在进行乙醇回流提取的过程中,采用75%乙醇,只回流30 min,目的在于尽量避免丹皮酚的损失。但由于丹皮酚为挥发性成分,在加热回流时难免对其造成损失,故测定结果显示,乙醇回流提取后成分的含量普遍低于甲醇超声提取。
在2005年版《中华人民共和国药典》中,赤芍以所含成分芍药苷作为质量控制的指标,丹皮酚在药材中含量较低,在干燥和加工等炮制过程中,受到温度的影响导致其含量降低,因此,在炮制的过程中应适当控制温度以避免丹皮酚的损失。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2005.119-120.
[2] 赵陆华.中药高效液相色谱应用[m].北京：中国医药科技出版社,2004. 201.
[3] 尹永宇.丹皮酚提取工艺研究[j].中成药,1995,17(9)：2-3.
[4] 李玉贤,万 炎,陈晓岚,等.牡丹皮中丹皮酚的提取方法研究[j].河南中医学院学报,2007,24(2)：125-126.
[5] 张克荣,毕开顺.芍药质量评价方法研究[d].沈阳：沈阳药科大学,2003. 45.
