作者：代云才 郭渝 胡伟 罗立 张琳琳

    【摘要】  目的  探讨羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中的应用价值。 方法  普通培养法对350例羊水标本进行细胞培养染色体核型分析。结果  350例羊水标本一次培养成功340例，一次培养成功率约97.1%。其中引产羊水标本60例，染色体核型分析未见异常；35岁或35岁以上的高龄孕妇羊水标本158例，染色体核型分析发现异常核型有1例47，xy,+21，1例47，xxx；1例46,xy,15p+。异常核型约1.9%；产前筛查唐氏高风险孕妇132例，核型分析结果异常有2例47，xy,+21；1例46， xy ,t(6;19)（q12;q134）。异常核型约2.3%。结论  羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中具有较高的应用价值。
    【关键词】  细胞遗传学  产前诊断  羊水细胞培养  染色体核型分析
    【abstract】 objective  to discussion amniotic fluid cell raise karyotype analysis technology in cytogenetics pre-natal diagnosis application value.methods  the ordinary culture bottle law carries on the cell culture chromosome analysis to 350 example amniotic fluid specimen.results  350 cases example amniotic fluid specimen one time raises the successful 340 examples, a raise success rate of about 97.1%.and induces labor the amniotic fluid specimen 60 examples, the chromosome karyotype analysis has not seen exceptionally; 35 year-old or 35 year-old above advanced age pregnant woman amniotic fluid specimen 158 examples, chromosome karyotype analysis abnormal result: 1 example is 47，xy,+21, 1 example is 47, xxx; 1 example is 46, xy,15p+, abnormal karyotype approximately 1.9%; prenatal screening downsyndrome high risk pregnant woman 132 examples, karyotype analysis abnormal result: 2 example are 47，xy,+21,1 example is 46, xy, t (6; 19) (q12; q134). abnormal karyotype approximately 2.3%.conclusion  the amniotic fluid cell raise karyotype analysis technology has the high application value in the cytogenetics pre-natal diagnosis.
    【key words】 cytogenetics  prenatal diagnosis  amniotic fluid cell culture  karyotype analysis
    羊水细胞培养染色体分析技术是细胞遗传学产前诊断的金标准。wwW.11665.cOM但在羊水细胞培养过程中，存在易污染、染色体标本片的制备难度大，分裂相较少，对操作人员的素质和技术要求高等问题，难以在基层临床实验室普及和应用。羊水细胞培养染色体核型分析是产前诊断胎儿染色体病的主要手段，我们为了掌握该分析技术，经两年的研讨，已将该技术运用于细胞遗传学产前诊断。现将结果报道如下。
    1  材料与方法
    1.1试剂  (1)羊水培养基；(2)25cm2羊水培养瓶；(3)低渗液；(4)秋水仙素为10μg/ml；(5)其他试剂为磷酸盐缓冲液、牛胰蛋白酶、吉姆萨染液。
    1.2仪器  (1)co2恒温培养箱；(2)bcm-1000型生物净化工作台；(3)离心机；(4)恒温干燥箱；(5)恒温水箱；(6) yjtf-2a型通气柜; (7) olymbus bx51型倒置显微镜；(8)显微成像染色体分析系统。
    1.3羊水标本  (1)羊水标本均来自我院2007年12月-2009年12月经引产、产前筛查和产前诊断的孕妇，年龄19-45岁，共350例。其中引产孕妇60例，孕期19-28周；高龄孕妇（年龄≥35岁）158例，孕期17-24周；产前筛查高风险孕妇132例，孕期17-24周。
(2)羊水采集:经b超定位后，常规消毒，采用22号pie穿刺针穿刺，最初用5ml注射器抽取约2ml羊水弃去，再换20ml注射器抽取羊水约20ml，无菌操作注入2个一次性使用无菌刻度离心管中，盖好管帽，立即送实验室接种培养。(3)羊水标本状态：严重血性羊水标本15例，正常羊水标本335例。
    1.4方法  普通培养法:将采集的羊水离心沉淀，再将其沉淀物转入羊水培养瓶内，并加入一定量的羊水培养基进行培养。经更换培养液、再培养后，羊水细胞生长良好，此时，向培养瓶内加入一定量的秋水仙素，使羊水细胞的分裂停止在其分裂中期，再经低渗、固定、制片、显带、染色处理，即可得到可用于染色体核型分析的羊水细胞标本片。羊水细胞传代：用无菌吸管吹打待传代的培养瓶内的活细胞，使其在外力作用下脱离培养瓶底，并悬浮于培养液里，然后将该培养液直接转入新的培养瓶内进行传代培养，培养3-5天后即可换液，再培养3-5天后羊水细胞生长良好，收获可得到理想的染色体分裂相。
    2  结果
    共350例羊水标本，一次培养成功340例，一次培养成功率97.1%。其中引产60例，一次培养成功59例，一次培养成功率98.3%。羊水细胞核型分析结果未见异常；唐氏筛查高风险132例，一次培养成功128例，一次培养成功率97.0%。羊水细胞核型分析结果2例47,xy,+21, 1例46,xy,t(6;19)(q12;q134)；35岁或以上158例，一次培养成功153例，一次培养成功率96.8%。羊水细胞核型分析结果1例47,xy,+21，1例47,xxx，1例46,xy,15p+。
    3  讨论
    羊水细胞培养、染色体标本片的制备难度大，技术要求高。要制作出较好的羊水细胞染色体标本片，首先要保证羊水培养成功。我们的一次培养成功率约为97.1%。要保证羊水培养具有较高的成功率，必需掌握下列关键技术：(1)无菌操作技术：实验室微生物污染是细胞培养中的难题之一，所以从羊水标本的采集、离心沉淀细胞、接种培养、换液、传代等每一操作步骤都须要严格无菌操作，避免微生物污染才能保证羊水细胞培养成功。(2)被血液稀释的羊水标本的处理技术：据文献报道，不同的实验室处理方法也不尽相同。我室对血液严重稀释的羊水标本加入适量抗凝剂以防止红细胞凝集而不做其他任何特殊处理，与一般羊水标本一样培养到6-8天后换液，用无菌生理盐水洗涤2-3次后，再加羊水培养基3ml，3-5天后羊水细胞生长良好，收获可得到理想的染色体分裂相。据文献报道红细胞的存在会影响羊水细胞的生长，但我们的检测结果未证实这点。(3)羊水细胞传代技术：一般采用胰酶消化法传代。我室采用无菌吸管吹打法传代。这可避免因过多的操作环节造成的污染。(4)羊水细胞的收集：一般采用胰酶消化法收集羊水细胞。我们采用一次性使用弯曲吸管吹打、刮取贴壁生长的羊水细胞，使其脱落，然后将其收集于刻度离心管内。

   在我们的研讨中有1例孕期28周的羊水标本一次培养未成功，原因可能是孕期超过25周后，羊水中的有毒物质如胎脂、胎粪等增多，这些有毒物质要抑制羊水细胞的贴壁生长，使羊水培养不成功。1例产前筛查高风险羊水标本二次培养未成功，可能与其羊水中活细胞相对减少有关。
    羊水细胞来源于胎儿，因此，羊水细胞培养染色体核型分析就是对胎儿染色体核型分析，可对胎儿是否患有染色体病做出明确诊断,达到产前诊断的目的。染色体病是由于染色体数目或结构异常而发生的疾病，染色体数目异常比结构异常更为常见。我们的检测结果既有染色体数目异常如47，xy,+21， 47，xxx；又有染色体结构异常如 46，xy，t(6;19)（q12;q134）。在数目异常中主要是21三体，称为先天愚型。胎儿多余的21号染色体破坏了基因组遗传物质间的平衡，导致出生后发育异常。其临床表现多样，以智力低下最为突出。该病是细胞遗传学产前诊断中最常见的疾病，其在新生儿中的发病率为1/600，而我们检测胎儿的结果是3/350。其次为性染色体数目异常，如47，xxx。我们的检测结果是1/350。染色体结构异常中最常见的是染色体易位，易位又分为平衡易位、罗氏易位和单向易位。如我们检测到的46，xy，t(6;19)（q12;q134）属于平衡易位。这在各号染色体间均可发生，新生儿的发生频率约1-2/1000。平衡易位携带者虽然表型正常,但其可产生异常的精子和卵子,当异常的精子或卵子与正常的卵子或精子结合后,即可产生染色体异常的胚胎,从而导致染色体异常儿的出生。46,xy,15p+，一般认为如果胎儿父母之一为15p+，胎儿15p+属正常，我们对胎儿的父母做了血液染色体核型分析，结果未见15p+，那么胎儿15p+从何而来！这只能认为异常。
    综上所述，只要能保证羊水细胞培养成功，并制作出较好的染色体标本片，就能对胎儿羊水细胞染色体是否存在数目异常或结构异常做出明确诊断。因此，羊水细胞培养染色体核型分析技术在细胞遗传学产前诊断中具有较高的应用价值。 
参 考 文 献
[1]castrovolio i, sandermangelk, vargaspradom, et al. cytogeneti-cal prenatal diagnosis by amniocentesis during the ii and iii gestationtrimesters in costa rica[j].rev bioltrop, 2001, 49: 1227-1236. 
[2]郑育红,孙筱放,孙小蔓.原瓶传代培养应用于羊水产前诊断中的研究[j].中国优生与遗传杂志,2002,1(6):58-59.
[3]turhann0,erenu,seckinnc.second-trimestergeneticamniocente-sis:5-year experien[j].archgynecolobstet，2005，271：19-21.
[4]李从青,丛林,姚洁等.117例羊水细胞培养结局及影响因素的探讨[j].安徽医科大学学报,2009,(06):769-771.
[5]剡红民,强荣,陶囡等.羊水细胞培养技术在产前诊断的应用[j].实用医技杂志，2006(23):35-37.
[6]刘晓翌，肖晓素，樊尚荣等.羊水细胞染色体制备方法的研究[j].中国妇产科临床杂志，2004(4):296-300.
[7]林壮.产前诊断羊水细胞培养分析[j].中国现代药物应用，2008(2):71-72.