摘要：采用高效液相色谱法建立了虫草酒中虫草素含量的测定方法，探讨了色谱柱类型、流动相组成、柱温以及检测波长对分析结果的影响。研究表明：当色谱柱为wondasiltm c18 柱（150mm×4.6mm i.d.,5μm）； 流动相为乙腈－水(体积比为10:90)，流速为1ml/min；检测波长258nm；柱温40℃；进样量5μl 时分离、检测效果最佳，此法操作简便，样品只需用0.45μm 微孔滤膜过滤处理，线性范围宽、重现性好、精密度高，效果令人满意，对于虫草酒的生产和质量检测都具有现实的指导意义。
关键词：高效液相色谱；北虫草酒；北虫草素；测定

        0  引言
        北虫草属是一大类昆虫病原真菌，其特定的菌感染特定的昆虫就会成为具有重要的药用价值的冬虫夏草。冬虫夏草是特产于我国的真菌类名贵中药，目前人工栽培已获得成功。北虫草酒是用冬虫夏草为原料，以纯粮白酒为浸剂配以适当添加剂经深加工精制而成[1]，对气管炎、风湿病、关节炎、糖尿病疗效明显并具有防癌、抗肿瘤、补气血、延年益寿等多种保健功能[2]。虫草素是虫草酒中重要的活性成分，为含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱，是一种核苷类抗生素。虫草素对45种枯草杆菌中的43种有抑制作用，也有抗病毒和抗肿瘤作用[3]。Www.11665.CoM北虫草素的含量是评价北虫草酒质量的一个重要标，但未见北虫草酒中北虫草素的含量测定方法的报道。
        1  材料与方法
        1.1 仪器与试剂。日本岛津lc-20at高效液相色谱仪；spd-20a紫外-可见分光光度检测器；lcsolution色谱工作站；乙腈为色谱纯；乙酸、乙醇为分析纯；水超纯水；虫草素标准品（sigma公司），纯度大于99%。虫草酒样品由黑龙江省新医圣生物科技有限公司提供。
        1.2 样品处理。取适量待测北虫草酒样品，用0.45μm微孔滤膜过滤后密封，备用。
        1.3 色谱条件。色谱柱：wondasiltm c18柱（150mm×4.6mm i.d.，5μm）；流动相：乙腈－水（体积比为10：90），流速1ml/min；检测波长258nm；柱温40℃；进样量5μl。
        2  结果与分析
        2.1 色谱条件的选择。
        2.1.1 流动相的确定。在实验过程中先后选用了甲醇－水、乙腈－水并用乙酸调节不同的ph值作为流动相，实验结果表明：在中性条件下的分离效果稍好于酸性条件下的分离效果且有机溶剂消耗较少、操作简便、有利于降低成本；乙腈－水作流动相时保留时间较短且分离效果好，总体上要优于甲醇－水做流动相，因此选用中性条件下的乙腈－水作为流动相。 
        通过改变流动相的配比可以发现，当乙腈的体积分数大于10%时，虫草素出峰时间较短，各峰重叠，分离度较小，干扰目标组分的分析；当乙腈的体积分数小于10%时，尽管各组分保留时间的差异较大，分离彻底，但是随着乙腈含量的降低，北虫草素的出峰时间也随之延长，浪费流动相和分析时间，峰形展宽严重，故选定乙腈－水的体积比为10：90。

       2.1.2 色谱柱、柱温及检测波长的确定。在运用高效液相色谱进行分析测试中常用的有c8和c18两种分析色柱，实际操作过程中大多为反相色谱，实验表明：采用c18柱对北虫草酒中的北虫草素进行分析时分离度要稍高于c8柱且峰形也较好。实验中选用室温、35、40℃三个温度梯度进行实验，发现柱温对于样品的分离效果和保留时间影响均较小，但在柱温为40℃时保留时间稍短且分离效果也较好，故选择柱温为40℃。北虫草素在245～260nm紫外区有强吸收，在进行分析测试时吸收越强误差越小，实验中选定258nm作为检测波长，效果令人满意。
        2.2 标准曲线的绘制。用电子天平准确称取北虫草素8.0mg用无水乙醇溶解，定容于5ml容量瓶中，得到1.6mg/ml的北虫草素标准乙醇溶液，按照逐级稀释法又分别得到0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mg/ml的虫草标准待测乙醇溶液，按照1.3的色谱条件得到峰面积a，以峰面积a对浓度c（mg/ml）做标准曲线，通过线性回归得回归方程：a=7042.28+45862.02c（r=0.9996）。
        实验表明：当北虫草素浓度在0.0125～1.6mg/ml范围时，峰面积和浓度具有良好的线性关系，其相关系数达0.9998，而北虫草酒中虫草素的含量一般在0.2~1.4mg/ml之间，因此上述回归方程完全适合于北虫草酒中北虫草素含量的测定。
        2.3 精密度试验。取同一北虫草酒样品4份按1.2方法处理样品，在1.3的色谱条件下测得北虫草素的含量分别为0.521、0.519、0.520、0.518、0.522mg/ml，平均值0.520mg/ml，相对标准偏差rsd为1.03%。
        2.4 样品分析。取4份不同的北虫草酒样品按照1.2处理，在1.3色谱条件下做3次平行测定。
        2.5 加标回收试验。
        3  结论
        用高效色谱法测定北虫草酒中虫草素的含量，样品预处理简单结果准确，重现性好，精密度高，效果令人满意；流动相为乙腈－水（体积比为10：90），流速为1ml/min；检测波长258nm；柱温40℃；进样量5μl时分离、检测效果最佳。本文建立的北虫草酒中北虫草素含量测定方法对于北虫草酒的生产和质量检测都具有重要的现实指导意义。
参考文献：
[1]孙东方，张含江. 虫草酒的研制[j].酿酒，2004，31（1）：56.
[2]王常绮，姜平，王立义.虫草酒对健康成人血流变与微循环的研究[j].辽宁中医，1996，23（2）：85-86.
[3]chiou w f，chang p c，chou c j，et al. protein constituent contributes to the hypotensive and vasorelaxant activities of cordyceps sinensis[j].life sci，2000，66（14）：1369.