作者:张翼飞 姜立新 郑海涛
【摘要】 目的 检测结直肠癌组织中e-钙粘素的表达及其淋巴结微转移,探讨两者间的关系。方法 以ck20 mrna为标记物,应用rt-pcr对60例结直肠癌根治性手术切除的淋巴结标本共782例进行检测;免疫组化法(sp法)检测结直肠癌组织、癌旁组织、淋巴结微转移及正常对照组中e-钙粘素的表达。通过二者的综合分析,试图发现抑癌基因e-钙粘素在结直肠癌淋巴结微转移的生物学行为中的作用。结果 ck20法检出45例(75.0%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为436个(55.8%);常规病理学检出34例(56.7%)患者有淋巴结转移,检出阳性淋巴结数为356个(45.5%);两组比较,差异具有统计学意义(χ2=16.72,p<0.05)。11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)e-cadherin表达阴性,而15例未检出淋巴结微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者比较差异有统计学意义(χ2=4.160,p=0.041)。结论 e-cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。www.11665.com
【关键词】结直肠癌;e-钙粘素;淋巴结转移;逆转录聚合酶链反应
【abstract】 objective purpose to detect the expression of e-cadherin in colorectal carcinoma and lymph node micrometastases,and investigate their relationship.methods 82 cases of lymph node simple was dectected with rt-pcr method using ck20 mrna acridinium ester.in screening colorectal carcinoma lymph node micrometastases. e-cadherin expression analysed byimmuno-histochemical staining (the sp method) in colorectal cancer tissue, tissue nearby cancer, the normal control tissue. results in 60 cases of colorectal carcinoma,the expression of e-cadherin was 71.67%.number of positive nodes was 55.8%, the expression of e-cadherin was 56.7%(34 cases) and number of positive nodes was 45.5%(356 cases) through routine pathological examination. the low level expression of e-cadherin was positively correlated with the dukes staging, serosa infiltration, lymph node and liver metastasis of colorectal carcinoma(χ2=16.72,p<0.05).the expression of e-cadherin was negative in 6 of the 11 patients with lymph node micrometastases,and in 6.67%1 of the 15 patients without lymph node micrometastases(χ2=4.160,p=0.041).conclusion the negative expression of e-cadherin may contribute to lymph node micrometastases in colorectal carcinoma.
【key words】
colorectal carcinoma; e-cadherin; lymphatic metastasis; rt-pcr
结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。每年有10%的恶性肿瘤患者死于结直肠癌[1,2]。术后复发和转移是影响结直肠癌预后的最主要因素之一。在实施了根治性手术的结直肠癌患者中,仍有20%~50%的患者死于术后肿瘤的局部复发和转移[3,4],有研究认为该现象与结直肠癌淋巴结微转移有关。e-cadherin粘附分子介导细胞粘附的紊乱涉及肿瘤的发展和转移。e-cadherin表达或功能的丧失与癌细胞丧失分化和较高的侵袭能力有关。本研究通过免疫组化方法检测e-cadherin粘附分子在结直肠癌和转移灶的表达,以ck20为靶目标,应用rt-pcr法检测结直肠癌淋巴结的微小转移,以探讨结直肠癌浸润转移相关基因的表达与临床分期、浸润转移的关系。探讨结直肠癌组织中e-cadherin的表达及其与淋巴结微转移的关系,试图对结直肠癌转移做出预测和早期诊断,为临床治疗提供依据和手段。
1 实验材料及方法
1.1 实验材料
1.1.1 病例与标本 收集我院2005~2007年散发性结直肠癌根治术后标本60例,其中男32例,女28例;年龄28~79,平均58.4岁。所有患者术前均未行放、化疗;剔除遗传性非息肉病性散发性结直肠癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度:高分化23例,中分化21例,低分化16例;淋巴结转移34例,无淋巴结转移26例;tnm分期i期6例,ii期26例,iii期22例,iv期6例。术中采集散发性结直肠癌患者肿瘤周围肿大淋巴结共782个,剖开,一半行常规术后病理,另一半保存于-80℃冰箱备用。选择远癌“正常”大肠黏膜组织(距癌灶>4 cm)和癌旁(距癌灶<2 cm)大肠黏膜组织各10例作为对照观察。所有标本经10%福尔马林液固定,常规石蜡包埋。本研究得到医院伦理委员会批准,所有患者本人均签署知情同意书。
1.1.2 试剂 鼠抗人e-cadherin单克隆抗体和s-p试剂盒(zymed公司)。trizolreagent(invitrogen公司),takara amv逆转录试剂盒(takara公司),takara la taq(takara公司),pcr试剂(takara公司),dna分子量marker(晶美公司)。
1.2 方法
1.2.1 总rna的抽提 采用标准trizol法(参照说明书)提取术后淋巴结标本的总rna,凝胶电泳和分光光度计检测rna浓度和纯度。
1.2.2 cdna制备 总rna样品1 μl,依次加入oligo dt(18)0.5 μl,mgcl2 2 μl,10×rt buffer 1 μl,rnase free dh2o 3.75 μl,10 mmol/l dntp 1 μl,rnase inhibitor 0.25 μl,amv reverse transcriptase 0.5 μl。总反应混合物于30℃反应10 min,42℃反应30 min,99℃反应5 min,5℃反应5 min。
1.2.3 引物的合成 在ncbi数据库中查找编码人类基因ck20的核酸序列,其登录号为nm_019010,该序列长1817 bp,编码序列cds(coding sequence)位于43-1317 bp间。以此序列为基础,在cds区内设计引物。上游引物5’-acctaaatgaccgtctagcgagc-3’下游引物5’-cacattgacagtgttgcccagat-3’扩增片段为449 bp大小,引物由上海英俊公司合成。
1.2.4 pcr反应和分析 采用rt-pcr方法,以人结直肠癌淋巴结cdna为模版.反应体系为50 μl:cdna模版1 μl,10× la pcr缓冲液5 μl,25 mmol/l mgcl2 5 μl,20 pmol/μl 上游和下游引物各1 μl,10 mmol/l dntp mixture 2 μl,latag酶0.5 μl,补去离子水至50 μl。pcr反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃再延伸5 min。反应完毕后进行电泳分析。
1.2.5 结直肠癌组织切片厚4 μm,0.01 mol/l柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复,s-p免疫组化染色。染色步骤按说明书进行,dab显色,苏木精复染胞核。pbs代替第1抗体作阴性对照。
1.3 统计学方法 资料的统计分析在spss13.0软件包中进行,数值变量以均数(95%可信区间)表示,计数资料用率来表示,两组间率的比较采用χ2检验法。并采用诊断性实验分析方法计算ck20与传统病理切片技术诊断结直肠癌淋巴结转移的准确度、敏感度和特异度。
实验结果:
图a e-cadherin在正常大肠黏膜上皮细胞中的表达 40×
图b e-cadherin在结直肠癌组织中的表达 40×
2 结果
2.1 60例散发性结直肠癌患者的782个受检淋巴结经常规病理学检查,34例(56.7%)患者有淋巴结转移,阳性淋巴结总数为356个(45.5%)。而采用rt-pcr法检测ck20 mrna的表达情况来判断淋巴结转移,结果显示,45例(75.0%)患者有淋巴结转移,较病理学检查结果新增11例,差异具有统计学意义(χ2=4.483,p=0.034)。阳性淋巴结总数为436个(55.8%),较病理学检查结果新增80个,差异具有统计学意义(χ2=16.371,p<0.001)。
2.2 e-cadherin表达与结直肠癌临床病理参数的关系 e-cadherin在癌组织中的表达阳性率显著低于癌旁组织(p<0.05)。e-cadherin低表达与结直肠癌dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移呈正相关(p<0.05)。
2.3 11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例e-cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例表达阴性,两者差异有统计学意义(χ2=4.160,p=0.041)。
3 讨论
e-cadherin又称细胞-细胞粘附分子,广泛分布于各类上皮细胞间介导同型细胞间连接的、具有钙依赖性的粘附分子,其在胚胎发育、形态发生、上皮极性和完整性等方面起到重要作用[5]。其表达程度及功能活性状态直接影响细胞的脱落和再粘着,对维持组织结构的完整性、极性及细胞分化等起重要作用[6]。其表达下降时细胞的粘附作用减弱,使肿瘤细胞发生浸润和转移[7]。
本研究表明,e-cadherin在高分化型结直肠癌的表达明显高于未分化型的结直肠癌,提示e-cadherin与肿瘤的分化有关,可作为分子标记物来鉴别肿瘤的恶性程度。本组资料显示e-cadherin的异常表达与结直肠癌的病理组织类型无明显相关性,主要考虑与各型腺癌结构的分化和异型程度不一致造成,例如管状腺癌就包括高、中、低分化三种类型。
多数学者认为e-cadherin是肿瘤浸润抑制基因[8,9]。文献报道,结直肠癌e-cadherin表达异常与肿瘤分化及浸润深度密切相关,与本研究发现一致。可见e-cadherin可以作为大肠癌的标志物,协助判断大肠癌的预后。
研究证明,淋巴结微转移与患者预后直接相关。ck20是一种独特的i型细胞角蛋白,为具有严格的上皮特异性的癌细胞标志物,可稳定地存在于几乎所有的胃肠道癌及其转移癌中,正常血液及淋巴结的固有成分如淋巴细胞、内皮细胞一般不表达,是检测直肠癌微转移较特异的指标[10,11]。我们应用rt-pcr检测ck-20阳性率为(55.8%),而传统病理切片诊断为淋巴结转移的阳性率为(45.5%),两组间有显著性差异(p<0.001)。
11例检出淋巴结微转移患者癌组织中6例(54.5%)e-cadherin表达阴性,而15例未检出微转移癌组织中仅有1例(6.67%)表达阴性,两者差异有统计学意义(p=0.041)。本研究提示e-cadherin的表达减弱或消失参与了结直肠癌淋巴结微转移的发生。
参考文献
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