【摘要】 目的：探讨一氧化氮 (no)对小鼠皮肤半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)表达及屏障功能的影响。方法：1、2组采用粘带剥脱法处理小鼠皮肤，1组外用无菌蒸馏水作为实验组， 2组外用nos抑制剂l-name作为no抑制组， 0组不做处理作为对照组。处理后24 h检测各组皮肤经表皮水分丢失量(tewl)、caspase-14的表达及no产生量。结果：0、1、2组caspase-14的转录水平分别为1.00±0.05、10.51±1.29、3.88±0.58，蛋白表达水平分别为1.00±0.11、6.09±0.54、2.56±0.49，组间比较，差异有统计学意义(p<0.01)。no产生量为0组<2组<1组，差异有统计学意义(p<0.01)。tewl为0组<1组<2组，差异有统计学意义(p<0.01)。结论：小鼠皮肤屏障受损后，皮肤no产生量及caspase14的表达明显增加;外用nos抑制剂可下调小鼠皮肤no产生量及caspase-14表达，说明no可能通过调控caspase-14表达，从而影响皮肤屏障功能。
【关键词】 一氧化氮;半胱氨酸蛋白酶-14;皮肤屏障
渗透屏障功能是皮肤的重要生理功能之一，目前研究发现，半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)在角质形成细胞的终末分化中起重要作用，可作用于丝聚蛋白原使之水解成游离氨基酸并形成保湿因子，调节角质层的水合功能，与皮肤的渗透屏障功能密切相关 [1]。wWW.11665.cOM近年来研究也认为一氧化氮(no)在调节皮肤屏障功能中具有重要作用。本试验制作皮肤屏障破坏的小鼠模型，通过外用no合酶(nos)抑制剂，分别检测小鼠皮肤经表皮分丢失量(tewl值)、no产生量及caspase-14的表达，从而探讨no对小鼠皮肤caspase-14的表达及屏障功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料：balb/c小鼠由中山大学实验动物中心提供。sybr exscript tm rt-pcr kit(takara，大连宝生物公司)，引物由上海英骏公司合成，l-name(nos抑制剂)由英国tocris公司提供，抗小鼠caspase-14、β-actin一抗由美国santa cruz公司提供，hrp标记的羊抗兔二抗由美国sigma公司提供，no检测试剂盒由广州莱德尔公司提供。
1.2 方法
1.2.1 制作动物模型及分组：选取10～16周的雌性balb/c小鼠15只，随机分为0、1、2组，每组5只。在每只小鼠侧腹部选取约2 cm2的区域，剃毛露出光滑皮肤，0组不做处理作为对照组;1、2组采用粘带剥脱法处理小鼠皮肤，使其tewl达到70 g/(h·m2)左右。1组外用无菌蒸馏水作为实验组，2组外用1 μm的l-name作为no抑制组。各组分别于处理后24 h检测tewl。处理后24 h，0、1组小鼠取1 cm2大小皮肤培养于2 ml pbs中作为对照;2组同样皮肤培养于2 ml含1 μm l-name的pbs中。培养30 min后，取培养基上清液50 μl检测no含量。各组另取约1 cm2大小皮肤用于检测caspase-14表达。
1.2.2 tewl检测：tewl采用mpa9型皮肤多功能测试仪检测。检测条件：温度(25±0.5)℃，相对湿度(40±5)%。
1.2.3 real-time rt-pcr检测：采用trizol提取总rna，采用real-time rt-pcr对目标基因进行相对定量分析，操作按试剂盒说明书进行。caspase-14特异引物：a1,5′- cagcacgaggctctaact-3′;a2，5′- tgacaggctcttcccaat-3′，产物片段387 bp。β-actin特异引物：b1，5′-gagggaaatcgtgcgtgac-3′ ;b2，5′-agaaggaaggctggaaaa-3′，产物片段185 bp。采用20μl反应体系。pcr反应条件：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，56℃退火15 s，72℃延伸31 s，共40个循环。
1.2.4 caspase-14表达的western blotting检测：参考hong sp等提供的方法，以β-actin为内参照进行半定量分析[2]。
1.2.5 no检测：按试剂盒操作说明检测。
1.3 统计学处理：计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差检验和snk检验，数据经spss 13.0统计软件包处理，显著性水准α设为0.05。表1 各组小鼠皮肤tewl值、no值、caspase14的核酸转录及蛋白表达相对水平注：各类数据3组间差异比较，p<0.01;tewl值0、1组间两两比较p>0.05，no值0、2组间两两比较p>0.05，其他各组间两两比较p<0.05
2 结果
各组小鼠皮肤tewl值、no值、caspase-14核酸转录水平及蛋白表达水平检测：处理后24 h各组tewl值为0组<1组<2组，3组间差异有统计学意义(p<0.05)，但0、1组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。各组no值为0组<2组<1组，3组间差异有统计学意义(p<0.05)，但0、2组间两两比较差异无统计学意义(p>0.05);各组caspase-14转录水平及蛋白表达水平为0组<2组<1组，3组间差异及各组间两两比较差异有统计学意义(p<0.05)。详见表1。
3 讨论
近来研究发现，caspase-14参与皮肤角质层形成，可调节角质层的水合功能[3]。目前对caspase-14表达的具体调节机制尚不明确，但一般认为该酶在皮肤屏障的维持中具有重要作用。皮肤屏障受损后，角质形成细胞产生更多no，对微生物感染具有抑制作用，同时也导致机体一系列病理生理改变，故no对皮肤屏障的作用仍存在争议[4]。
在本实验中发现，小鼠皮肤屏障受损后，no产生增多，24 h后tewl值恢复至接近对照组水平;外用nos抑制剂者，no产生受到抑制，延缓了24 h后tewl的恢复，说明no对小鼠皮肤屏障的恢复过程有促进作用。其次，小鼠皮肤屏障受损后，caspase-14的表达上调;外用nos抑制剂者，caspase-14的表达相应下调，延迟皮肤屏障的恢复。这些说明caspase-14在皮肤屏障受损后对屏障恢复具有重要作用，另一方面也说明no可能通过上调受损皮肤caspase-14的表达，从而促进皮肤屏障的恢复。至于no对小鼠皮肤屏障功能是否存在其他影响，有待进一步研究。
【参考文献】
[1] denecker g，hoste e，gilbert b，et al.caspase-14 protects against epidermal uvb photo damage and water loss[j].nat cell biol，2007，9(4)：666.
[2] hong sp，kim mj，jung my，et al.biopositive effects of low-dose uvb on epidermis：coordinate upregulation of antimicrobial peptides and permeability barrier reinforcement[j].j invest dermatol，2008， 128(12)：2880.
[3] lippens s，denecker g，ovaere p，et al.death penalty for keratinocytes：apoptosis versus cornii cation[j].cell death differ，2005，12(8)：1497.
[4] feingold kr，schmuth m，elias pm.the regulation of permeability barrier homeostasis[j].j invest dermatol，2007，127(7)：1574.
