作者：曾志华，冯雯琪，卓廉士
【摘要】 目的： 研究 电针对非酒精性脂肪肝(nafld）肝细胞色素p450 2e1(cyp2e1)表达及氧化抗氧化的 影响 . 方法 ： 用高脂饲料诱导大鼠脂肪肝模型，同时给予电针 治疗 ，观察肝组织病理形态的变化和肝cyp2e1表达. 测定肝内丙二醛（mda），超氧化物歧化酶（sod），甘油三酯(tg)，总胆固醇(tc)以及谷胱甘肽（gsh）含量的变化. 结果： 与脂肪肝模型组比较，电针组的肝组织脂肪变性和炎性损伤得以改善. 免疫组化证明电针治疗能抑制脂肪肝肝细胞色素cyp 2e1的表达，同时肝内mda，tg，tc显著降低(p<0.01)，sod，gsh活性升高(p<0.01). 结论： 电针通过抑制脂肪肝细胞色素cyp 2e1的表达，从而减轻脂质过氧化反应，增强抗氧化能力，使肝组织的脂肪变性和炎性损伤得以改善.
【关键词】 非酒精性脂肪肝；肝细胞色素p450 2e1；氧化抗氧化；针灸治疗
0引言
随着国人生活水平提高，饮食结构变化，近年来由肥胖、高脂血症、糖尿病、营养失调等引起的nafld发病率呈上升趋势［1］. 研究表明［2-3］，nafld不再是一种良性及静止的病变，它可影响肝功能，易 发展 为脂肪性肝炎，长期的肝内脂肪蓄积可促进肝纤维化的发生直至肝硬化，甚至肝功能衰竭. 近年来，临床上常用针刺的方法防治nafld，安全有效，却鲜有实验方面对此作用机制的研究. 有研究表明［4］，肝细胞色素cyp2e1（liver cytochrome p450 2e1）在nafld的发病机制中主要参与脂质过氧化反应，对nafld的发生及发展起着重要作用. 据此，本研究采用高脂饲料诱导大鼠nafld模型，施以电针“治疗”，观测肝cyp2e1的表达和脂质过氧化反应的变化，现将结果报告如下.
1材料和方法
1.1材料雄性sd大鼠（重庆医科大学动物中心提供）；cyp2e1抗体，即用型sabc免疫组化染色试剂盒，dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；丙二醛（mda），超氧化物歧化酶（sod），谷胱甘肽（gsh），甘油三脂（tg），总胆固醇（tc）试剂盒为南京建成生物工程研究所提供.
1.2方法
1.2.1分组与造模雄性sd大鼠33只,体质量（170±20） mg，适应性饲养3 d后，标记后随机分为正常对照组（11只）和造模组（22只）. 造模采用陈世清造模法［5］，即喂养由100 g/l猪油、20 g/l胆固醇和880 g/l普通饲料混合而成的高脂饲料. 8 wk后随机断颈处死正常对照组大鼠1只和造模组大鼠2只，取出大鼠肝脏，取肝左叶， 40 g/l甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木精伊红染色，光镜下观察， 计算 机彩色图像系统成相，以验明造模情况. 将余下的造模组大鼠20只再予标记，再随机分为2组：nafld模型组10只；电针治疗组10只.
1.2.2电针治疗将造模成功的实验性肥胖大鼠随机分为两组，一组不做任何治疗，为模型组(n=10)；一组给予电针治疗，为电针组(n=10). 根据化痰利湿、活血化瘀的治则，取“丰隆”、“足三里”、“太冲”、“三阴交”穴. 针刺方法：置大鼠于“大鼠固定器中”（自制）中， 取一侧之上述诸穴，用32#毫针，分别剌入1 ~7 mm. 然后接通电针综合治疗仪（重庆医疗器械厂制造），采用频率10 hz，强度1.5 v连续波，以下肢轻微抖动为宜，保持大鼠清醒状态，１次／d ，每次15 min，连续“治疗” 4 wk，左右侧穴间日轮换. 治疗期间，模型组之大鼠亦将分别置入固定器中15 min，连续4 wk. 大鼠腧穴据《实验针灸学》定位［6］. 正常组始终喂基础饲料,模型组和电针组继续饲以高脂饲料.
1.2.3肝脏生化指标测定取大鼠之肝右叶，4℃下制成9 g/l的生理盐水肝匀浆液，3000 r/min离心10 min离心取上清液，按试剂盒说明书操作测定mda，sod，gsh，tc和tg.
1.2.4病 理学 及免疫组化检查取大鼠肝左叶，40 g/l甲醛固定后作常规he染色，观察肝组织的脂肪变程度. cyp2e1免疫组化染色，采用链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化法(sp)法，dab显色，一抗cyp2e1的工作浓度为1∶100，操作流程按试剂盒说明书进行. 每次实验均设阴性对照，以pbs替代一抗. cyp2e1免疫组化显示棕黄色颗粒为阳性，每张切片最少20个高倍视野观察棕黄色颗粒的染色程度，用ipp5.1免疫组化 分析 软件对图片阳性区域进行累积光密度值（iod）量化测定.
统计学处理： 采用spss 12.0软件， 数据结果用x±s表示，组与组之间比较采用方差分析(anova)中的lsd法，p<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1模型的验证在实验过程中,造模组大鼠体重增加、形体肥胖、皮毛发黄、蓬乱不顺滑. 肉眼可见造模组大鼠肝脏体积变大，边缘钝，颜色变黄，切面有油腻感. 光镜下可见正常组大鼠肝细胞排列紧密成索状，仅个别细胞内有少量脂滴, 造模组肝细胞质内有大量脂肪空泡呈透明状，胞核被脂肪空泡挤到肝细胞边缘（图1），病理证实造模组脂肪肝已形成.
2.2肝组织的病 理学 变化正常组肝组织肝小叶结构完整， 无变性坏死炎细胞浸润及纤维组织增生， 仅个别细胞内有少量脂滴； 模型组的所有动物均出现中度至重度的肝细胞脂肪变性， 大量肝细胞肿胀水肿， 胞浆内的脂滴多为大泡型， 偶有点状坏死， 汇管区炎细胞浸润明显，腺泡3区的脂肪变较2，1区重（图2）； 电针组经过 治疗 后肝组织脂肪变性和炎性损伤得以改善， 肝细胞结构趋于正常， 有少数肝细胞内可见有小泡型脂滴， 汇管区炎细胞浸润明显减轻（图2）.
2.3肝组织内cyp2e1表达cyp2e1免疫组化显示棕黄色颗粒为阳性. 正常组肝细胞内cyp2e1表达在中央静脉周围数个细胞层，未超过腺泡3区；模型组弥漫性表达，在中央静脉周围以腺泡2，3区为明显，延伸至1区；与模型组比较，电针组 cyp2e1表达在中央静脉周围以腺泡3区为明显，延伸至2区，1区未见到表达（图3）. 用ipp5.1软件对图片阳性区域进行累积光密度值（iod）测定（表1），模型组iod值显著高于正常组（p<0.01）,为强阳性表达；电针组iod值显著低于模型组（p<0.01）.
2.4大鼠肝tc，tg，sod，mda，gsh含量变化模型组tg，tc，mda含量高于正常组,sod，gsh低于正常组（p<0.01），电针组sod，gsh高于模型组, tg，tc，mda含量低于模型组（p<0.01，表1）.
3讨论
nafld是一种无过量饮酒史肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征. nafld的确切发病机制 目前 尚不清楚，但“二次打击学说”较为流行. 该学说认为胰岛素抵抗会导致肝脏脂肪沉积，成为nafld发病过程中的一次打击；而在肝脏脂肪沉积基础上所发生的氧化应激和脂质过氧化则形成二次打击［7］. 本实验结果表明，与模型组比较，电针组大鼠肝内tc，tg，mda显著降低，肝gsh，sod明显升高，且这些指标在两组中差异有统计学意义表1大鼠肝内cyp 2e1免疫组化图片累积光密度，tc，tg，mda，gsh，sod含量(p<0.01). 从病理组织学观察，通过电针治疗后，大鼠非酒精性脂肪肝肝组织小叶结构恢复，肝细胞条索较清晰，肝细胞内仅见少量小的脂肪空泡，肝脂肪变性显著减轻.. cyp2e1免疫组化结果显示, 与模型组比较,电针组cyp2e1表达受到一定程度的抑制,在中央静脉周围以腺泡3区为明显，延伸至2区，1区未见到表达. cyp2e1免疫组化图片累积光密度值（iod）测定结果表明，电针组iod值显著下降，与模型组比较差异有统计学意义（p<0.01）. 以上 研究 结果证实,电针治疗抑制肝cyp2e1的表达, 减轻脂质过氧化反应而使大鼠非酒精性脂肪肝获得明显的疗效. 虽然其机制还不太清楚， 但推测可能是电针通过抑制肝cyp2e1表达， 使自由基的生成减少， 从而减轻脂质过氧化反应， 增强机体抗氧化能力和肝细胞防御机制， 使肝脏的脂肪变程度和炎性损伤得以改善.
脂肪肝发生后，需经脂质过氧化这一生化和结构破坏性反应的打击才能导致肝脏发生炎症、坏死和纤维化，最终导致非酒精性肝病的发生. 研究表明，肝细胞色素cyp2e1的诱导表达是导致自由基大量生成，启动脂质过氧化反应的关键因素［8］. 脂质过氧化反应形成大量脂质过氧化物， 抑制抗氧化系统，从而启动肝细胞损伤的一系列级联反应，对肝脏实施二次打击，导致非酒精性肝病的发生及 发展 .
祖国医学认为脂肪肝属于“痰证”、“瘀证”和“积证”的范畴. 其病位在肝，但与脾肾有关. 由于过食肥甘厚味或饮酒过度，或感受湿热疫毒，或情志失调，或久病体虚等，导致脾失健运，痰浊内蕴；肝失疏泄，肝血瘀滞；进而肾气亏虚，痰瘀互结引发本病. 治疗予以疏肝理气，健脾燥湿，活血化瘀，补肝益肾等法.
太冲乃足厥阴肝经的原穴，可疏肝理气. 针刺丰隆既可化有形之痰，又可化无形之痰，调理脾胃，促进运化，豁其痰浊，以杜绝生痰之源. 足三里乃足阳明胃经的合穴，可调理脾胃. 三阴交为肝脾肾三经交会穴，可以增强调理肝脾之功，并能补肾益脾. 二者相配合，可泻阳明、太阴之湿，扶助脾胃运化输送功能. 诸穴合用，能奏行气活血，化瘀除痰之功. 有研究表明针刺足三里、丰隆可以改善血液流变学，降低tc，tg［9-10］，能有效地改善微循环，提高细胞免疫功能. 临床上常选用上述诸穴治疗nafld. 本实验也是通过针刺“丰隆”、“足三里”、“太冲”、“三阴交”穴，抑制肝cyp2e1表达及减轻脂质过氧化反应损伤，达到“治疗”大鼠nafld的目的. 实验结果表明，电针通过抑制肝cyp2e1表达，减轻脂质过氧化反应，使大鼠非酒精性脂肪肝获得了较好的疗效，此研究结果对 应用 电针治疗非酒精性脂肪肝有一定的 参考 价值.
【参考 文献 】
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［6］ 李忠仁. 实验针灸学［m］. 北京：
