作者：姚煜，田涛，崔洁，赵娜，郭亚焕，南克俊
【摘要】 目的： 探讨cox2和vegf在肝癌多细胞球体（mcs）中的表达与肝癌群集耐药的关系. 方法 ： 以liquid overlay技术获得肝癌hepg2多细胞球体为模型，采用透射电镜和扫描电镜比较单层细胞与mcs的形态学差异；采用mtt法和流式细胞技术比较adm和5fu对单层细胞和mcs的生长抑制率和细胞凋亡率；采用免疫组化和图像 分析 技术比较cox2和vegf在单层细胞和多细胞球体表达的差异. 结果： 与单层细胞相比，多细胞球体细胞间黏附广泛而紧密，可见中间连接和桥粒连接. 不同浓度的adm和5fu作用48 h，mcs细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均低于单层细胞，差异有统计学意义（p<0.05）. 免疫组化结果显示，cox2和vegf在mcs上高表达（p<0.05）. 结论： 肝癌mcs具有群集耐药性，可能与其高表达cox2和vegf有关.
【关键词】 肝癌；群集耐药；环氧化酶2；血管内皮生长因子
0引言
肿瘤细胞出现耐药现象是肿瘤化疗失败的主要原因之一. 三维细胞培养比平面细胞培养更能反映体内肿瘤的情况［1］. 我们检测肝癌多细胞球体（multicellular spheroids，mcs）对阿霉素（adriamycin，adm）和5氟脲嘧啶（5fluorouracil，5fu）的耐药性以及环氧化酶2（cyclooxygenase2，cox2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）在肝癌群集耐药（multicellular resistance，mcr）中的表达的关系，探讨肝癌mcs的耐药机制.
1材料和方法
1.1材料人肝癌hepg2细胞购自美国atcc，由本室保存；rpmi 1640培养液购自gibco公司；噻唑兰（mtt）和二甲基亚砜（dmso）购自sigma公司；annexin vfitc试剂盒购自晶美生物公司；cox2鼠抗人mab和vegf鼠抗人mab购自santa cruz公司. 透射电镜（hitachi，h600）；扫描电镜（jeol，jsm840）；高通量多功能微板测试系统（bmg，polarstar optima）；流式细胞仪（bd，fals calibar）；图像信号采集与分析系统（leica，q550cw）. 细胞平面培养采用常规方法，多细胞球体采用liquid overlay技术获得［2］，先将20 g/l琼脂糖0.5 ml在6孔板上铺一薄层，冷却后接种hepg2细胞（1×106/l） 2 ml，每48 h半量换液1次，4 d后形成mcs.
1.2方法
1.2.1细胞超微结构观察取平面细胞和mcs，置于25 g/l戊二醛固定液中4℃固定2 h，10 g/l四氧化锇固定液4℃后固定2 h，乙醇梯度脱水，置换，切片，喷金后用透射电镜和扫描电镜观察.
1.2.2细胞抑制率的检测将细胞接种于96孔板中，在不同浓度adm和5fu作用48 h后，每孔加入5 g/l mtt 20 μl，继续孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μl dmso振荡5 min，于492 nm波长处检测每孔a值，以不加药物组为空白对照， 计算 细胞抑制率. 细胞抑制率（%）=［(1-实验组a值)/对照组a值］×100%.
1.2.3细胞凋亡的检测单层细胞和mcs分别经不同浓度adm和5fu作用48 h后收集，按照试剂盒说明书加入annexin vfitc和pi，避光染色15 min后，上机检测细胞凋亡率.
1.2.4检测cox2和vegf的表达单层细胞制作细胞爬片，40 g/l多聚甲醛固定20 min后备用. mcs 40 g/l多聚甲醛固定1 h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片后备用. 根据试剂盒说明进行免疫组化染色，阴性对照用pbs代替一抗. 用leica q550cw图像信号采集与分析系统在统一光强下随机选择10个视野（10×20）计算平均灰度值，灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫反应性越高.
统计学处理: 采用spss 13.0统计软件进行统计学分析. 计量指标以x±s表示，用cox2和vegf的灰度值表示表达强度，组间比较用方差分析，p<0.05有统计学差异.
2结果
2.1单层细胞和mcs的形态学特点单层hepg2细胞贴壁生长，细胞表面有较多的微绒毛样突起，细胞间隙较大（图1a），细胞间连接少见，仅见一类似紧密连接样的结构（图1b）. mcs悬浮生长，细胞相互聚集并迅速增殖，形成细胞数目不等的球形多细胞聚集体，具有三维的结构特征，于培养后4 d直径达到200 μm左右(图1c)，细胞间黏附广泛而紧密，可见桥粒连接和中间连接（图1d）.
2.2单层细胞和mcs细胞抑制率的比较mtt实验结果表明，除0.15625 mg/l组以外，经0.3125，0.625，1.25和2.5 mg/l的adm作用48 h后，mcs的细胞抑制率低于单层细胞（p<0.05，图2a）；经6.25，12.5，25，50和100 mg/l的5fu作用48 h后，mcs的细胞抑制率低于单层细胞（p<0.05，图2b）.
2.3单层细胞和mcs细胞凋亡的比较经0.5，1.0，2.0 mg/l adm作用48 h后，mcs的细胞凋亡率低于单层细胞（p<0.05，图3a）；经40和80 mg/l 5fu作用48 h后，mcs的细胞凋亡率低于单层细胞（p<0.05，图3b）. 在20 mg/l 5fu组两者的细胞凋亡未见明显差异.
a: 扫描电镜下单层细胞形态（×1000）; b: 透射电镜下单层细胞形态（×3000）; c: 扫描电镜下mcs形态（×370）;d: 透射电镜下mcs形态（×60 000）
2.4cox2和vegf的表达差异cox2和vegf主要在胞质表达，呈棕黄色颗粒，对表达阳性的样本进行图像 分析 ，测平均灰度值作为表达强度的量化指标. 将单层细胞培养成mcs时，cox2和vegf的表达均增高（p<0.05）：单层细胞cox2的灰度值为190.8±9.4，mcs的平均灰度值为153.9±10.2；单层细胞vegf的灰度值为207.4±8.8，mcs的灰度值为186.8±13.9. 光镜下观察，单层细胞cox2和vegf仅个别细胞有弱的染色，而mcs大部分细胞有较强的染色（图4）.
a: cox在单层细胞中的表达; b: cox在mcs中的表达; c: vegf在单层细胞中的表达; d: vegf在mcs中的表达.
图4cox2和vegf在单层细胞和mcs中的表达×200
3讨论
肝癌耐药是 影响 化疗疗效和患者预后的重要原因. 尽管对于肿瘤耐药的 研究 ，已经有了很大的进展，如mdr基因的发现，但是这些都是平面培养的结果，忽略了肿瘤细胞与细胞之间，细胞与基质之间的相互影响. 多细胞球体在组织结构上与实体瘤相似，体外培养简单方便，是研究实体瘤的良好模型，mcs的耐药现象已经在多种肿瘤中得到证实［3］. 本研究表明，将肝癌hepg2细胞三维培养，当细胞相互黏附成为较致密的多细胞球体时，细胞与细胞之间的连接结构明显增多，细胞间的相互作用增强；同时细胞抑制率、细胞凋亡率的检测提示其对adm和5fu产生明显耐药. 这些说明我们所建立的肝癌群集耐药模型是成功的.
目前 ，已经提出许多机制来解释mcr［4］：①mcs中细胞具有不均质性，相对静止状态细胞的增多，使得对化疗敏感的细胞数量减少；②细胞间的黏附作用可以抑制细胞凋亡的发生，从而产生耐药；③mcs的环境引起的耐药相关基因的表达. cox2抑制剂可以通过激活死亡受体信号途径，caspase途径和线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡［5］.可见cox2的过度表达改变了细胞某些增殖和凋亡相关基因的表达，从而促进了肿瘤恶性行为的发生. liu等［6］用cocl2诱导几种前列腺癌细胞株vegf表达的上调幅度与cox2的上调幅度基本一致，且选择性cox2抑制剂ns398可使vegf的表达受抑，表明cox2的表达和vegf相关. 研究表明，在白血病细胞中，vegf可以诱导抗凋亡因子bcl2的表达，从而抑制凋亡［7］.
在本研究中，cox2和vegf在mcs中的表达明显高于单层细胞，提示这可能是导致肝癌hepg2细胞mcr的重要原因之一. 当单层细胞黏附聚集成致密的多细胞球体时，细胞间连接的增多，mcs中心区缺氧的发生，环境因素的改变可能导致了cox2和vegf表达的增加，从而促进了细胞增殖，抑制了细胞凋亡，参与了mcr的发生.
【 参考 文献 】
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