作者：王一敏，张献清，贺静，曾成鸣
【摘要】 目的: 研究 氨基酸对牛胰岛素淀粉样纤维的生成、形态和细胞毒性的 影响 . 方法 : 采用硫黄素（tht）荧光检测牛胰岛素形成淀粉样纤维的动力学曲线，透射电镜观察纤维形态；以淀粉样纤维诱导人红细胞的聚集和溶血为指标评估纤维对细胞膜的损害作用. 结果: 牛胰岛素在ph 1.6，57℃的条件下，可在1.5 h开始形成淀粉样纤维，5种氨基酸即组氨酸（his）、脯氨酸（pro）、苏氨酸（thr）、谷氨酰胺（gln）和精氨酸（arg）具有延迟胰岛素纤维化的作用，同时改变了淀粉样纤维的形态. 胰岛素在形成淀粉样纤维后可在较低的浓度范围内诱导人红细胞溶血和聚集，该作用随着纤维的生长逐渐增强. 虽然在氨基酸作用下延迟生长的纤维具有不同的纤维形态，但并不能改变纤维对细胞膜的损害作用. 结论: 牛胰岛素在形成淀粉样纤维后具有破坏细胞膜结构的作用. 氨基酸可以抑制胰岛素的纤维化作用. 胰岛素纤维对红细胞膜的损害作用与其形态和生长动力学无关.
【关键词】 淀粉样纤维； 牛胰岛素； 氨基酸； 红细胞； 淀粉样变性
0引言
许多蛋白质在一定条件下由于错误折叠而形成淀粉样纤维沉积，现已发现至少20多种人类疾病与因蛋白的错误折叠而导致淀粉样纤维沉积有关［1-4］. 胰岛素蛋白在特定条件下容易形成淀粉样纤维从而可能导致对患者的免疫原性［5］. 研究［6-8］表明，精氨酸(arg)能够促进错误折叠的蛋白质重新折叠而恢复天然活性,并且发现其有稳定蛋白构象的作用. 根据我们近期的实验结果，所有20种常见氨基酸对蛋白质构象均具有一定的稳定作用. 我们选取包括arg在内的5种氨基酸，研究其对牛胰岛素纤维生长的抑制作用，并以人红细胞聚集和溶血为指标，探索不同条件下生成的胰岛素纤维对细胞膜的损害作用.
1材料和方法
1.1材料新鲜全血来自志愿者捐献，用枸醛酸抗凝；牛胰岛素、硫黄素（thioflavin t, tht）（sigmaaldrich公司）；其他均为国产 分析 纯试剂. h600型透射电镜（日本日立公司），varian cary eclipse型荧光光度计（美国varian公司），3k30型冷冻离心机（sigma公司）；1240型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司).
1.2方法
1.2.1胰岛素淀粉样纤维在含有100 mmol/l nacl的盐酸（ph1.6）中配制1 g/l牛胰岛素水溶液，加入50 mmol/l氨基酸，于57℃水浴中孵育，按一定的时间间隔取样，加入到20 mmol/l trishcl（ph 8.0）中，加10 μmol/l tht，混匀后检测tht荧光强度，激发波长440 nm，发射波长482 nm. 制作纤维生长曲线. 并同时检测胰岛素纤维生长过程中各级聚集体对红细胞的损害作用. 所有的氨基酸都是相同条件.
1.2.2纤维形态观察取成熟胰岛素纤维（孵育12 h） 5 μl，用二次蒸馏水5倍稀释，点样10 μl于镀膜的铜网上，10 min后用滤纸吸干，再滴加10 μl双氧铀（20 g/l）溶液染色，3 min后吸干，在透射 电子 显微镜下观察并拍照.
1.2.3溶血检测取新鲜全血于4℃，750 g离心10 min，吸去上层血浆和白细胞，用等渗pbs（150 mmol/l nacl，2.7 mmol/l kcl，10 mmol/l na2hpo4，2 mmol/l nah2po4，ph 7.4）洗涤3次. 分离的红细胞用等渗pbs稀释，加入胰岛素纤维，使红细胞浓度为20 ml/l，纤维浓度为0.1 g/l. 细胞悬液于37℃水浴30 min后，4℃，750 g离心10 min，取上清液于540 nm处测a值.
1.2.4红细胞聚集取新鲜配制的40 ml/l红细胞加入胰岛素纤维，红细胞终浓度为20 ml/l，37℃孵育30 min，取15 μl滴片观察并照相.
统计学处理: 采用spss 10.0版统计软件进行统计学处理，多个样本均数比较采用方差分析.
2结果
2．1纤维生长曲线随着纤维的生长，tht的荧光强度在经过一个快速上升阶段后达到平台期，表明纤维已达到成熟阶段，氨基酸的加入延迟了胰岛素纤维的生长（图1）.其中，arg的作用最强，在监测的12 h内，荧光值无升高.连续监测至第3日荧光值未见升高.
his：组氨酸；pro：脯氨酸；thr：苏氨酸；gln：谷氨酰胺；arg：精氨酸.
图1胰岛素纤维的生长曲线
2．2胰岛素的纤维形态加入his的纤维为长丝状，纤维的半径较小；加入脯氨酸（pro），苏氨酸（thr）和谷氨酰胺（gln）处理的纤维形态相似，均聚集呈网束状，其中pro处理的纤维比其他纤维更短，半径也较大. 加入arg的体系在后孵育12 h后，蛋白仅以无定形聚集体的形式存在，直至孵育60 h后才能观察到有极少量的纤维（图2）.
a: 胰岛素对照; b: 组氨酸; c: 脯氨酸; d: 苏氨酸; e: 谷氨酰胺; f: 精氨酸.
图2不同生长条件下胰岛素纤维20 g/l双氧铀溶液染色×50 000
2．3胰岛素纤维的溶血活性和诱导红细胞聚集的作用溶血作用随纤维的生长而增强，但在纤维进入成熟阶段时其作用有所减弱（数据未示出）. 对不同条件下生长的纤维的细胞毒性作用进行比较，结果表明胰岛素纤维和加入氨基酸后生长的胰岛素纤维都具有溶血作用，但差异无统计学意义. 加入arg处理的胰岛素在12 h时无纤维生长，也不具有溶血活性，72 h时仍无明显溶血作用（数据未示出）. 较低浓度的胰岛素纤维（<0.04 g/l）无溶血活性，但有聚集红细胞的作用，此聚集作用与纤维生长的进程呈正相关. 除his以外，这种作用的大小与纤维的形态无关. 加入arg处理的胰岛素在72 h内无诱导细胞聚集的作用（图3）.
3讨论
蛋白质由于错误折叠而形成淀粉样纤维沉积，是很多人类疾病的诱因之一.蛋白质聚集后会失去部分a: 胰岛素蛋白; b: 胰岛素纤维; c: 组氨酸; d: 脯氨酸; e: 苏氨酸; f: 谷氨酰胺; g: 精氨酸.
图3氨基酸处理后牛胰岛素纤维诱导的红细胞聚集×40
或全部活性，溶解性降低，免疫原性也会发生改变［4-5，7］. tht可特异地与淀粉样纤维结合，在特定的波长下荧光强度的大小与淀粉样纤维形成的含量成正比［9］. 我们的结果表明，加入氨基酸能有效地延迟了纤维的生长. 不同氨基酸的延迟作用各有不同，在所选取的5种氨基酸中， arg作用最强. 所以，arg可以作为一种有效的抑制剂，防止蛋白质制剂的变性和纤维化. 在加入氨基酸的体系中，纤维的形态也有一定程度的改变，加his后形成的纤维为长丝状，与不加任何氨基酸处理的胰岛素纤维形态部分相似，都是中空结构，只不过后者的纤维较短并聚集成束状. 加pro， thr和gln后形成的纤维无中空结构，呈不同程度的束状聚集. 在arg存在下，胰岛素很难形成淀粉样纤维. 红细胞溶血和聚集实验表明，不同纤维的细胞毒性仅有很小的差别. 即淀粉样纤维形态上的差别并没有改变其生物毒性，这与 目前 普遍认为的淀粉样纤维的细胞毒性主要取决于其中的β折叠结构是一致的. 我们的结果表明，小分子氨基酸可以在较小的浓度范围内（50 mmol/l）抑制胰岛素的纤维化. 因此由一些较强作用的氨基酸组成的寡肽可能会成为蛋白质变性的强力抑制剂. 这类抑制剂与合成有机物相比，将具有更好的生物相容性. 此外，我们报道了非病原性蛋白胰岛素在形成淀粉样纤维后，与β淀粉样肽一样［10］具有诱导细胞 内容 物大量渗透的作用. 这种作用与淀粉样纤维在细胞膜聚集，通过插膜作用破坏细胞膜结构并形成非专一性离子通道密切相关.
【 参考 文献 】
［1］ 涂荣波,董军. β淀粉样蛋白在老年痴呆症发生 发展 中的作用及其机制 ［j］. 第四军医大学学报,2007, 28(1): 91-93.
［2］ stefani m. protein misfolding and aggregation: new examples in medicine and biology of the dark side of the protein world ［j］. biochim biophys acta, 2004, 1739: 5-25.
［3］ kayed r, head e, thompson jl, et al. common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis ［j］. science, 2003, 300: 486-489.
［4］ ban t, yamaguchi k, goto y. direct observation of amyloid fibril growth, propagation, and adaptation ［j］. acc chem res, 2006, 39: 663-670.
［5］ arora a, ha c, park cb. inhibition of insulin amyloid formation by small stress molecules ［j］. febs letters, 2004, 564:121-125.
［6］ liu yd, li jj, wang fw, et al. a newly proposed mechanism for arginineassisted protein refoldingnot inhibiting soluble oligomers although promoting a correct structure ［j］. protein expr purif, 2007, 51:235-242.
［7］ arakawa t, ejima d, kita, y, et al. small molecule pharmacological chaperones: from thermodynamic stabilization to pharmaceutical drugs ［j］. biochim biophys acta, 2006, 1764: 1677-1687.
［8］ arakawa t, tsumoto k. the effects of arginine on refolding of aggregated proteins: not facilitate refolding, but suppress aggregation ［j］. biochem biophys res commun, 2003, 304: 148-152.
［9］ krebs mh, bromley ec, donald am. the binding of thioflavint to amyloid fibrils: localization and implications ［j］. j struct biol, 2005, 149: 30-37.
［10］ jang h, zheng j, nussinov r. models of betaamyloid ion channels in the membrane suggest that channel formation in the bilayer is a dynamic process ［j］. biophys j， 2007, 93: 1938-1949.
