作者：王汉民，谭华，赵洪雯，张鹏，黄朝晖，何丽洁，陈光磊，吴雄飞
【摘要】 目的: 探讨川芎嗪对缺血/再灌注（i/r）损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的 影响 . 方法 : 将大鼠随机分为假手术（s）组、i/r组、再灌注后给予川芎嗪（tmppost）组、再灌注前给予川芎嗪（tmppre）组，各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐，光镜和电镜观察肾组织形态学变化，原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数，免疫组化和免疫印迹法检测肾脏bcl2和bax蛋白的表达. 结果: tmppre组较i/r组血尿素氮和肌肝显著降低，肾小管损伤评分减轻，分别为［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/l，p＜0.01) ］，［（196±55）vs （295±64）μmol/l，p＜0.01）］，［(372±46) vs （563±62），p＜0.01) ］；肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻，肾组织凋亡细胞数明显减少［（13.6±2.9） vs （28.8±4.6），p<0.01）］；bcl2蛋白表达明显增强［（1.15±0.12） vs （0.88±0.12），p<0.05）］，bax表达明显减弱［（0.87±0.11） vs （1.15±0.09），p<0.05）］. 结论: 川芎嗪可明显减轻i/r肾损伤，其保护作用机制与bcl2蛋白表达增强和bax蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡有关.
【关键词】 川芎嗪；肾脏；再灌注损伤；细胞凋亡；保护
【abstract】aim: to explore ligustrazine (tetramethylpyrazine, tmp) on the effect of in rats wit rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of related genes in rats with. methods: forty wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), i/r model(n=10), tmppost (n=10, intraperitoneal tmp 32 mg/kg per 6 h after reperfusion for 30 min) and tmppre (n=10, intraperitoneal tmp 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. renal cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dutp nick end labeling(tunel). the expressions of bcl2 and bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by western blot analysis. the kidney histology were observed by light and electron microscope. results: compared with those in the tmppre group, the blood urea nitrogen［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/l，p＜0.01］, the creatinine ［（196±55） vs （295±64）μmol/l，p＜0.01）］ and the score of injury in renal tubules ［(372±46) vs （563±62），p＜0.01) ］ were decreased significantly in i/r group. the changes of injury and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenuated in tmppre group. by tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, p<0.01) and the expression of bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, p<0.05) were decreased significantly, and the expression of bcl2(1.15±0.12 vs 0.88±0.12, p<0.05) was increased significantly as compared with that in i/r group. conclusion: tetramethylpyrazine can attenuate kidney i/r injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes bcl2 and bax.
【keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection
0 引言
川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的一种生物碱单体，其基本化学结构为四甲基吡嗪，具有扩张血管、改善微循环等作用，临床上广泛用于心脑血管疾病的 治疗 ，并取得较好疗效. 川芎嗪对肾脏缺血/再灌注（i/r）损伤的保护作用已被大量 研究 证实［1-2］，但这种保护作用的机制尚不完全清楚，我们通过观察川芎嗪对i/r损伤大鼠肾功能、肾组织形态学、细胞凋亡及bcl2和bax蛋白表达的影响，进一步探讨川芎嗪对肾i/r损伤的保护作用机制.
1 材料和方法
1.1 材料 健康成年wistar大鼠40只，雌雄不拘，体质量200～240 g（第四军医大学实验动物中心），动物许可证号scxk（军2002005），标准饲料，自由进食水，普通光照. 兔抗大鼠bcl2和bax mab、兔抗βactin（santa cruz公司）；免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；原位细胞凋亡(tunel)试剂盒（美国roche公司）；细胞裂解液（美国bdbiosciences公司）；bca试剂盒（美国pierce公司）；sds聚丙烯酰胺凝胶（美国invitrogen公司）；硝酸纤维素膜（美国life science公司）；血尿素氮（bun）、血肌酐（cr）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（无锡第七制药厂，批号02081911）. jem100sx型透射电镜（日本jeol公司），凝胶图像 分析 系统（美国kodak公司）等.
1.2 方法
1.2.1 分组及动物模型制备 将40只大鼠随机分为4组，每组10只. s组：假手术对照组；i/r组：缺血再灌注模型组；tmppost组：在i/r模型的基础上，再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪，32 mg/kg，每6 h 1次，共4次；tmppre组：在制备i/r模型前24，16，8 h，45 min腹腔注射川芎嗪, 32 mg/kg，i/r造模后不再注射川芎嗪. i/r模型制作参照basile等方法进行［3］，用30 g/l戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断45 min后松开动脉夹. 假手术组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再关闭腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，采血并摘取左肾，血标本以4000 r/min 离心10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定bun和cr. 取部分肾组织分别用40 g/l甲醛和30 ml/l戊二醛固定以制备石蜡切片和电镜切片，另取部分肾组织迅速置入液氮中，然后于-80℃冰箱保存，用于提取蛋白.
1.2.2 肾功能测定 测定血bun采用二乙酰一肟显色法，测定血cr采用碱性苦味酸比色法， 应用 721分光光度计测定.
1.2.3 肾组织学观察 石蜡切片行he和pas染色，光镜下观察肾组织形态学改变，参照paller等方法进行评分［4］，每只大鼠肾组织随机选择10个视野（×200），每个视野下随机选择10处肾小管，共按100个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重. 电镜切片行醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察肾组织的超微结构变化.
1.2.4 肾组织细胞凋亡检测 采用tunel检测细胞凋亡指数，参照tunel试剂盒说明书进行，显色采用dab试剂盒进行. 光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域、光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡指数（ai）.
1.2.5 肾组织bcl2，bax免疫组化染色 采用兔抗鼠bcl2和bax mab，参照抗bcl2和bax试剂盒进行，显色采用dab试剂盒进行. 光镜观察胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞.
1.2.6 western blot检测肾组织bcl2，bax蛋白表达 称取肾组织，按常规加入细胞裂解液，进行组织匀浆，取上清液用bca试剂盒进行蛋白定量，经100℃ 10 min 变性后，用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染液染膜，脱脂奶粉于室温封闭，与bcl2，bax抗体37℃孵育4℃过夜. 摇洗并加入二抗室温孵育，再次洗涤，滴加显色液至硝酸纤维素膜上，x光胶片感光，用kodak凝胶图像分析系统进行灰度扫描.
统计学处理：计量资料用 x±s表示，多组样本均数之间比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用多个均数间的多重比较（dunnettt检验），应用spss13.0统计软件，p＜0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1肾功能的变化 各组血bun和cr变化见表1.
表1 各组血bun和cr、凋亡指数及肾小管损伤程度评分的比较（略）
ap＜0.05，bp＜0.01vs i/r组. s：对照组；i/r：缺血/再灌注组；tmppost：i/r造模后给予川芎嗪；tmppre：i/r造模前给予川芎嗪.
2.2 肾组织形态学改变 各组肾小管损伤程度评分结果见表1. s组光镜观察肾组织无明显病变，电镜亦未见明显异常. i/r组光镜可见皮髓间有明显淤血带，肾小管上皮细胞刷状缘消失，出现空泡、滴状变性，严重者细胞脱落、坏死、基底膜裸露. tmppost组光镜改变较i/r组有所减轻，而tmppre组光镜改变较i/r组明显减轻，表现为部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡及滴状变性少见、部分管腔扩张、可见少量管型. i/r组电镜可见部分肾小管上皮细胞核染色质致密，成团块状附在核膜上，出现染色质边集，上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、线粒体减少或消失、内质网扩张. tmppost组肾小管细胞超微结构损伤较i/r组有所减轻. tmppre组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较i/r组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构相对完整，线粒体肿胀，少见空泡形成，核膜完整.
2.3肾组织细胞凋亡的变化 各组肾组织细胞凋亡指数见表1，tunel检测肾组织凋亡细胞结果见图1.
a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.
图1 各组tunel免疫组化染色 sabc ×400（略）
2.4 bcl2，bax蛋白表达 在tmppre组肾小管上皮细胞中bcl2表达明显，而bax在i/r组肾小管上皮细胞中表达明显（图2，3）. western blot检测支持肾组织免疫组化染色的结果，采用灰度扫描显示bcl2在tmppre组表达最高，而bax在i/r组表达最高（图4，5）.
3 讨论
肾脏i/r损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的病理生理现象，可以导致急性肾衰竭（arf）和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上皮细胞. 研究 表明［5］，肾脏i/r损伤后除发生细胞坏死外，细胞凋亡也是其重要的死亡形式. 细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控，bcl2家族就是其中之一，对细胞凋亡起着重要的调控作用［6］. 大量的研究［7-8］证实缺血性arf时存在肾脏细胞凋亡，本研究得出了相似的结果：i/r组肾功能损伤明显，凋亡细胞数量增多，提示肾脏细胞凋亡数量与肾功能损伤程度密切相关.
a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.
图2 各组bcl2免疫组化染色 sabc ×400（略）
凋亡是缺血性损伤后细胞死亡的重要形式，细胞凋亡受多种凋亡相关基因及其蛋白的调控，与凋亡相关的基因通常分为抗凋亡基因和促凋亡基因. bcl2是一种重要的抗凋亡基因蛋白，而bax为bcl2 家族成员，其作用则与bcl2 相反，具有促凋亡作用. reed［9］认为，bcl2高表达或bcl2/bax比值升高可抑制bax的活化，从而抑制细胞凋亡. 本研究结果显示， 应用 川芎嗪能使肾脏i/r过程中细胞凋亡指数下降，bcl2蛋白表达增强，bax 蛋白表达减弱，bcl2/bax比值增高. 表明川芎嗪能抑制肾脏i/r过程中肾脏细胞凋亡的发生，且川芎嗪的肾脏保护作用与抑制bcl2/bax介导的细胞凋亡密切相关，提示在肾脏i/r损伤中，细胞凋亡是可以预防的.
大量的研究［10-11］证实川芎嗪对i/r损伤的肾脏有明显的保护作用. 本研究结果表明，肾脏i/r前后应用川芎嗪均具有肾脏保护作用，在i/r前给予川芎嗪效果更明显，表现在tmppre组肾功能明显好转，肾小管上皮细胞超微结构损伤明显减轻. 我们推测：早期应用川芎嗪能在肾脏缺血期及再灌注早期对抗细胞损伤因子，稳定线粒体膜，从而更好地保护肾脏细胞，而晚期给药则难以在短期内缓解细胞已遭受的严重损伤.
a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.
图3 各组bax的免疫组化染色 sabc ×400（略）
图4 western blot检测各组bcl2和bax蛋白表达（略）
a：对照组；b：缺血/再灌注（i/r）组；c：i/r造模后给予川芎嗪；d：i/r造模前给予川芎嗪.
ap＜0.05，bp＜0.01 vs i/r组.
图5 各组bcl2和bax蛋白表达（略）
本研究可得出以下结论：肾脏i/r损伤时细胞凋亡数量增加，bcl2和bax 蛋白表达较正常增强，bcl2/bax比值下降，肾功能恶化. i/r前应用川芎嗪能减少肾脏细胞凋亡，上调bcl2蛋白并同时下调bax 蛋白的表达，明显改善肾功能. 因此，川芎嗪对肾脏i/r损伤，可通过调节bcl2和bax蛋白的表达，抑制细胞凋亡起到肾脏保护作用.
【 参考 文献 】
［1］ feng l, xiong y, cheng f, et al. effect of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in murine kidney［j］. transplant proc, 2004, 36(7):1949-1951.
［2］ 王 忠，翁国星，杜 建. 川芎嗪对缺血再灌注肾保护作用的研究［j］. 福建中医学院学报，2005，15（2）：26-27.
［3］ basile dp, donohoe d, cao x, et al. resistance to ischemic acute renal failure in the brown norway rat: a new model to study cytoprotection［j］. kidney int, 2004, 65(6):2201-2211.
［4］ paller ms, hoidal jr, ferris tf. oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat［j］. j clin invest, 1984, 74(4):1156-1164.
［5］ nogae s, miyazaki m, kobayashi n, et al. induction of apoptosis in ischemiareperfusion model of mouse kidney: possible involvement of fas［j］. j am soc nephrol, 1998, 9(4):620-631.
［6］ devarajan p, mishra j, supavekin s, et al. gene expression in early ischemic renal injury: clues towards pathogenesis, biomarker discovery, and novel therapeutics［j］. mol gene metab, 2003, 80(4):365-376.
［7］ saikumar p, venkatachalam ma. role of apoptosis in hypoxic/ischemic damage in the kidney［j］. semin nephrol, 2003, 23(6):511-521.
［8］ 谭 华，王汉民，潘 龙，等. 缺血预处理对大鼠急性肾缺血/再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡的 影响 ［j］. 第四军医大学学报，2004，25（9）：818-821.
［9］reed jc. proapoptotic multidomain bcl2/baxfamily proteins: mechanisms, physiological roles, and therapeutic opportunities［j］.cell death differ, 2006, 13(8):1378-1386.
［10］ sun l, li y, shi l, et al. protective effects of ligustrazine on ischemiareperfusion injury in rat kidneys［j］. microsurgery, 2002, 22(8):343-346.
［11］ 王汉民，吴雄飞，谭 华，等. 川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及bcl2和bax表达的影响［j］. 第四军医大学学报，2006，27（20）：1884-1887.
