【摘要】 目的 探讨术中局部应用川芎嗪对自体移植静脉再狭窄的影响及其作用机制。方法 建立家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型，随机分为两组：pluronicf127 gel组和川芎嗪组。pluronicf127 gel组在静脉移植物外膜涂抹pluronicf127 gel凝胶，川芎嗪组在静脉移植物外膜涂抹由pluronicf127 gel凝胶携带的川芎嗪。分别于术后3、7、14 d用免疫组织化学方法检测移植静脉壁的增殖细胞（brdu阳性细胞）数，he、masson染色后应用计算机图像分析系统测量术后14 d移植静脉内膜厚度、中膜厚度及内膜厚度/中膜厚度（i/m）。结果 术后14 d，川芎嗪组移植静脉内膜厚度、中膜厚度、i/m值均明显低于pluronicf127 gel组，分别减少68.35%、22.02%，54.48%，差异有统计学意义(p<0.05)；术后3、7、14 d，川芎嗪组的细胞增殖指数均低于pluronicf127 gel组，分别减少约31.78%、41.03%、38.75%，差异有统计学意义(p<0.05)。结论 用pluronicf127 gel携带川芎嗪涂抹自体移植静脉外膜可使移植静脉内膜、中膜增生减轻，对静脉移植物早期再狭窄有良好的防治作用，其机制可能与川芎嗪作用于移植静脉外膜细胞靶点有关。
【关键词】 川芎嗪 静脉移植物 血管再狭窄 家兔
the study of preventing autologous vein graft restenosis by smearing
ligustrazine on the testing vessel adventitia
du junjie，liu zhiyong，lu qitong（department of cardiothoracic surgery,zhongda hospital,southeast university,nanjing 210009,china）
abstract:objective to investigate the effect of smearing ligustrazine locally on the preventing of vein graft failure and its mechanism.methods rabbit models of jugular veins grafted into the common carotid arteries were prepared.animals were randomly divided into pluronicf127 gel group (smearing pluronicf127 gel on the adventitia of autologous vein grafts) and ligustrazine group(smearing ligustrazine mixed with pluronicf127 gel on the adventitia of autologous vein grafts).brdu were localized by immunohistochemical procedure 3 days,7 days and 14 days after the operation.fourteen days after the operation,the thickness of neointima,media and neointima/media ratios (i/m) were calculated from the sections stained with he and masson by computer image analysis system.results fourteen days after the operation,the thickness of neointima,media and i/m ratios in ligustrazine group had significantly changed comparing to pluronicf127 gel group:(1)the thickness of neointima was decreased by 68.35%.(2) the thickness of media was decreased by 22.02%.(3) i/m ratios was decreased by 54.48%.from 3 days to 14 days compared to pluronicf127 gel group,the proliferating rate of vessel in ligustrazine group decreased by 31.78%，41.03%，38.75%,respectively.conclusions smearing ligustrazine mixed with the pluronicf127 gel on the autologous vein grafts can inhibit the proliferation of the vessel proliferating cells,at least partly by inhibiting the adventitia activation,and alleviate the hyperplasia of both neointima and media.
key words:ligustrazine;vein graft;vascular restenosis;rabbit
(modern medical journal，2008，36:159162)
血管平滑肌细胞增殖、迁移导致内膜增厚是冠状动脉旁路移植术后静脉移植物再狭窄的主要原因。Www.11665.Com川芎嗪（ligustrazine）对心血管系统有多种药理作用，最近实验研究表明，川芎嗪对血管再狭窄病理过程中的多个环节具有干预作用。我们通过建立家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型,在静脉移植物外膜涂抹由pluronicf127 gel携带的川芎嗪，观察其对血管再狭窄的影响，探讨其可能机制,为临床应用川芎嗪防治移植静脉再狭窄提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
普通级雄性家兔40只(东南大学医学院动物实验中心提供)，体重2.2～2.6 kg。随机分为两组： pluronicf127 gel组和川芎嗪组。pluronicf127 gel组在静脉移植物外膜涂抹pluronicf127 gel凝胶，川芎嗪组在静脉移植物外膜涂抹由pluronicf127 gel凝胶携带的川芎嗪。各组再随机分为3d组、7d组、14d组和28d组进行观察，每小组5只家兔。
1.2 试剂应用
川芎嗪购自哈尔滨三联药业有限公司,pluronicf127 gel、5溴脱氧尿核苷（brdu）和brdu单抗均购自美国sigma公司，非生物素辣根酶标记羊抗小鼠多聚体pv6002购自武汉博士德生物工程有限公司。称取pluronicf127gel粉末0.2g，加入灭菌pbs 1ml(0.01mol·l-1,ph 7.6)中充分搅拌，即制成pluronicf127 gel凝胶。称取川芎嗪30mg加入1ml pbs(0.01mol·l-1)中，再加入pluronicf127 gel粉末0.2g，充分搅拌，即成川芎嗪pluronicf127 gel的混合物。
1.3 建立模型
家兔以3%戊巴比妥钠30mg·kg-1耳缘静脉注射麻醉，固定、消毒，颈部直切口，游离并剪取右侧颈外静脉2.0～3.0 cm，用含0.30 g·l-1罂粟碱及0.15 g·l-1肝素钠的生理盐水浸泡；显露同侧颈总动脉，无创血管夹夹闭其两端，倒置静脉段，用70 prolene线行静—动脉端—侧连续缝合，结扎两吻合口之间动脉，确定静脉移植物血流通畅及术野无出血后，pluronicf127 gel组家兔静脉移植物外膜涂抹pluronicf127 gel凝胶，川芎嗪组家兔涂抹川芎嗪pluronicf127 gel混合物，然后逐层缝合，关闭切口。术后连续3d肌肉注射青霉素80万u。
1.4 标本分析
将brdu溶于乳酸林格液，配制浓度为33mg·ml-1，在取材前24h以75mg·kg-1 经家兔耳缘静脉注射。分别于术后3、7、14、28d活体取材,获取移植静脉段，4%中性甲醛固定，每段血管分3等份横断，石蜡包埋，连续切片。he、masson染色后测量静脉移植物内膜厚度(i)、中膜厚度(m)以及内膜厚度/中膜厚度(i/m)，每个标本取6个视野，400倍光镜下观察，取其平均值。免疫组织化学法检测brdu阳性细胞数，每个标本取6个视野，400倍光镜下分别记数每个视野中的阳性细胞数和总细胞数，取其平均值，计算阳性细胞/总细胞比值，作为细胞增殖指数。
1.5 统计学处理
数据以x-±s表示，采用spss 16.0软件进行方差分析，组间比较应用q检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 术后14d两组移植静脉内膜和中膜厚度比较
见表1。
表1 术后14 d两组移植静脉内膜、中膜厚度及i/m值与pluronicf127gel组比较，*p<0.05
术后14d两组移植静脉内膜、中膜均不同程度地增厚，但川芎嗪组内膜、中膜厚度及i/m值均明显低于pluronicf127gel组(p<0.05)，说明川芎嗪对术后静脉移植物内膜、中膜增生具有显著抑制作用。
2.2 免疫组织化学染色
见图1。
a. pluronicf127gel组；b. 川芎嗪组
图1 术后3d静脉移植物管壁标本（箭头所示为brdu阳性细胞） brdu染色×400 免疫组织化学染色结果显示，brdu阳性细胞于术后3d首先出现在静脉移植物外膜，两组血管外膜均见棕褐色brdu阳性细胞（图中箭头所示），但川芎嗪组明显少于pluronicf127gel组；7d时brdu阳性细胞出现在外膜及中膜；14d主要出现在新生内膜。
2.3 术后两组移植静脉细胞增殖指数比较
见表2。
表2 术后两组移植静脉细胞增殖指数 与pluronicf127gel组同一时间点相比，*p<0.05
由表2可见，在术后不同时间点川芎嗪组细胞增殖指数均明显小于pluronicf127gel组，且在第7天时川芎嗪组的抑制细胞增殖作用达到最强。
3 讨 论
3.1 川芎嗪的抗血管再狭窄作用
川芎嗪是由中药伞形科植物川芎的根茎提取的，属于酰胺类生物碱，化学结构为2,3,5,6四甲基吡嗪(tmp)。最近实验研究证明，川芎嗪对心血管系统有多种药理作用。罗红琳等［1］观察发现，川芎嗪可剂量依赖性地抑制离体培养的血管平滑肌数目的增多。唐利龙等［2］用northern杂交方法发现，川芎嗪能明显抑制血管平滑肌细胞前胶原α1、α3基因的转录，而胶原的合成在ptca术后再狭窄的过程中起重要作用。陈可翼等［3］制备经皮动脉腔内成形术后兔髂动脉、腹主动脉再狭窄的模型，发现川芎嗪组再狭窄部位血管平滑肌的成纤维细胞生长因子mrna、原癌基因cmyc mrna阳性杂交信号表达较非用药组再狭窄部位明显减少，比正常组增加；抑癌基因p53mrna、内皮衍化舒张因子mrna杂交阳性信号表达与正常组相比则有减少，与非用药组相比有所增加。另外，范治云等［4］研究表明，川芎嗪在抑制家兔动脉粥样硬化模型主动脉内膜病变的同时，可剂量依赖性地抑制家兔血小板聚集和5羟色胺释放。
我们通过实验建立了家兔颈总动脉自体颈外静脉移植模型，并于术中在静脉移植物外膜涂抹川芎嗪，结果显示，术后14d川芎嗪组移植静脉内膜、中膜厚度与pluronicf127gel组相比较，分别减少了68.35%、22.02%,i/m减少了54.48%（p<0.05），证实了川芎嗪对术后静脉移植物再狭窄具有显著的抑制作用。
通过比较两组3、7、14d各时间点静脉移植物细胞增殖指数，我们发现川芎嗪组细胞增殖指数在不同时间点均较pluronicf127gel组有不同程度降低，分别降低了31.78%、41.03%和38.75%；川芎嗪在第7天时抑制细胞增殖作用最强。提示：（1）术后7d左右是血管重塑的高峰期；（2）川芎嗪可通过抑制局部细胞增殖来发挥其抑制静脉移植物术后再狭窄作用。其具体作用机制尚不明确，是否与川芎嗪上述的多种药理作用有关，有待进一步研究。
3.2 血管外膜细胞在再狭窄中的角色
研究表明，血管内皮细胞、中膜血管平滑肌、外膜成纤维细胞均不同程度地参与了血管再狭窄的发生［57］。自体静脉移植物再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚，增厚内膜主要由中膜血管平滑肌增殖、迁移及合成大量细胞外基质而形成，增厚内膜中还含有活化的外膜成纤维细胞及炎症介质［8］。过去着重于研究内膜和中膜的反应，很少注意外膜以及外膜细胞在血管再狭窄中的作用。okamoto等［9］用球囊损伤猪冠状动脉，发现从损伤后2h到第7天在损伤部位的外膜有黏附分子和嗜中性粒细胞特异性的cxc趋化因子的mrna表达，而这些黏附分子和趋化分子在正常血管组织不表达，说明血管成形术可引起外膜炎症反应。另外，血管外膜成纤维细胞的作用也开始受到关注。scott等［10］利用免疫组织化学方法进行研究，发现血管损伤后3d血管外膜即出现增殖细胞，并随着时间延长有向中膜、内膜迁移的倾向；同时发现外膜细胞在增殖的同时发生表型转化，表达α肌动蛋白(αactin)，具有平滑肌细胞的某种特征，并称之为肌成纤维细胞。
在我们的实验中，一方面pluronicf127gel组brdu阳性细胞（即增殖细胞）出现的时间、空间分布与scott等的实验描述完全一致，表明在促使血管再狭窄的过程中，血管外膜的炎症反应和外膜成纤维细胞的增殖、迁移的确起到了重要作用；另一方面川芎嗪组3d时可见外膜增殖细胞明显受抑制，提示川芎嗪可能作用于静脉移植物外膜的有关靶点发挥其抑制血管再狭窄的作用。
3.3 局部用药的可行性
药物动力学研究［11］表明，川芎嗪分子中的甲基很容易被氧化，生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速排出体外。故川芎嗪在临床应用中有代谢快、半衰期短和生物利用度较低的缺点，疗效尚不能令人满意。另一方面，药物的长期或静脉大剂量应用增加其发生不良反应的可能性，同时加重患者的经济负担。本实验采用在静脉移植物外膜涂抹含30mg·ml-1川芎嗪的pluronicf127 gel凝胶，由于pluronicf127 gel具有携带及缓释作用，因此，使得川芎嗪对自体静脉移植物的作用得以持续、足量地发挥，保证了川芎嗪有效的作用部位、作用时间、作用浓度，避免了全身应用时产生的副作用，具有方便、经济、安全等优点。但由于本实验未设计不同剂量组，故川芎嗪的抗血管再狭窄作用是否具有剂量依赖性及其量效关系如何尚不得而知，有待进一步研究。另外，pluronicf127 gel在体内7d左右开始逐渐分解，并丧失其载体作用［12］，故还需要寻找、开发一种对人体无害的、携带药物更持久的载体。
【参考文献】
［1］罗红琳，袁淑兰，肖静，等.川芎嗪抗离体培养动脉平滑肌细胞增强作用的实验研究［j］.华西药学杂志，1997，12(1)：67.
［2］唐利龙，汪丽惠，张均华，等.川芎嗪对原代培养血管平滑肌细胞胶原基因表达的影响［j］.中国中西医结合杂志，1995，15(11)：666668.
［3］陈可翼，史大卓.川芎嗪的化学、药理与临床应用［m］.北京：人民卫生出版社,1999:111113.
［4］范治云，罗红，刘玉兰，等.川芎嗪的抗炎作用与组胺、5羟色胺的关系［j］.中药新药与临床药理，2004，15(2)：9394.
［5］numaguchi y,okumura k,harada m,et al.catheterbased prostacyclin synthase gene transfer prevents instent restenosis in rabbit atheromatous arteries ［j］.cardiovasc res,2004,61(1):177185.
［6］horlitz m,sigwart u,niebauer j.fighting restenosis after coronary angioplasty:contemporary and future treatment options ［j］.int j cardiol,2002,83(3):199205.
［7］siow r c,mallawaarachchi c m,weissberg pl.migration of adventitial myofibroblasts following vascular balloon injury:insights from in vivo gene transfer to rat carotid arteries ［j］.cardiovasc res,2003,59(1):212221.
［8］newby a c.an overview of the vascular response to injury:a tribute to the late russell ross ［j］.toxicol lett,2000,112113:519529.
［9］okamoto e,couse t,de leon h,et al.perivascular inflammation after balloon angioplasty of porcine coronary arteries ［j］.circulation,2001,104:22222228.
［10］scott n a,cioplla c d,ross c e,et al.identification of potential role for the adventitia in vascular lesion formation after balloon overstrench injury of porcine coronary arteries ［j］.circulation,1996,93(2):21782187.
